血管緊張素Ⅱ-1型受體自身抗體介導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡對經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后再狹窄的影響及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　近年來，冠心病的發(fā)病呈逐年上升且低齡化的傾向，已成為我國重大的公共衛(wèi)生問題。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（Percutaneous Coronary Intervention，PCI）是目前冠心病血運恢復(fù)的重要臨床手段。中國接受PCI治療人數(shù)的逐年增加，年平均增長率在10％-15%，但 PCI術(shù)后再狹窄嚴(yán)重限制了血運重建的遠(yuǎn)期效果，即便隨著新一代DES廣泛應(yīng)用，再狹窄率仍高達(dá)12%，因此關(guān)于再狹窄的研究一直是近年的熱點。P

2、CI術(shù)后再狹窄的本質(zhì)是血管內(nèi)膜損傷部位組織的過度愈合反應(yīng)，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞基質(zhì)沉積使新生內(nèi)膜過度增生所致，內(nèi)皮損傷是引起血管再狹窄的始動因素及主要環(huán)節(jié)，加速局部內(nèi)皮化，促進內(nèi)皮快速修復(fù)可降低再狹窄，而內(nèi)皮修復(fù)延遲，則可導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生。
　　內(nèi)皮是如何修復(fù)的呢？傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為血管內(nèi)皮損傷后主要通過循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖來修復(fù)損傷血管，至20世紀(jì)末，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial progenitor ce

3、lls，EPCs）才真正是損傷的血管再內(nèi)皮化的重要細(xì)胞來源。EPCs由骨髓干細(xì)胞衍生，在生理或病理因素刺激下，可由骨髓動員到外周血，歸巢于損傷部位，并增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促進損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)。PCI致血管損傷后EPCs可快速動員然后定植于損傷部位，加速再內(nèi)皮化，從而有效減少平滑肌細(xì)胞增殖，抑制內(nèi)膜的過度增生。已有研究證實PCI術(shù)后再狹窄患者外周血中無論EPCs數(shù)量、還是其增殖能力、遷移能力均顯著降低。所以，PCI術(shù)后再狹窄形成的進程中

4、，EPCs數(shù)目減低或/和功能下降或是支架術(shù)后再狹窄的關(guān)鍵因素所在。
　　血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)最主要的生物學(xué)活性分子，其在促進細(xì)胞分化、增殖、生長及調(diào)節(jié)血管張力、血容量方面均有重要作用。多項研究顯示AngⅡ可以促進EPCs凋亡，減少其數(shù)量，引起EPCs功能下降，而阻斷AngⅡ后可以明顯減少EPCs凋亡數(shù)量，改善其功能，其機制主要是促進活性氧的生成，誘發(fā)機體的氧化應(yīng)激、降低端粒酶活性，加速

5、EPCs衰老和凋亡，而此作用可被纈沙坦阻斷。
　　近年國內(nèi)外一些研究在惡性高血壓、先兆子癇、腎移植等患者血清中均發(fā)現(xiàn)了抗AT1R的自身抗體（Angiotensin II type1 Receptor Autoantibodies，AT1-AA）的存在，其可通過專一識別結(jié)合 AT1受體的細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段（the second extracellular loop of the angiotensin II type1 rec

6、eptor，AT1R-ECⅡ），激活A(yù)T1受體，產(chǎn)生與AngⅡ激活A(yù)T1R相類似的生物學(xué)效應(yīng)。
　　目前，AT1-AA在 PCI術(shù)后支架再狹窄方面的研究還處于初期階段，AT1-AA是否會導(dǎo)致支架再狹窄，是否通過影響EPCs而發(fā)揮作用，通過何種機制尚不清楚。本文將對以上幾個方面問題進行研究。
　　第一部分：AT1受體自身抗體滴度與冠脈支架植入術(shù)后再狹窄的關(guān)系分析
　　目的：
　　在惡性高血壓、先兆子癇、腎移植患者血

7、清中可檢測到抗血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(AT1-AA)的存在,該自身抗體可激活A(yù)T1受體，與AngⅡ激活A(yù)T1R產(chǎn)生相類似的生物學(xué)效應(yīng)。我們將探討冠脈支架植入術(shù)后再狹窄與AT1-AA的關(guān)系。
　　方法：
　　根據(jù)PCI術(shù)后患者冠脈造影復(fù)查結(jié)果是否發(fā)生支架再狹窄分為再狹窄組和非再狹窄組（分別為50例和60例），同時設(shè)置冠心病組（已行冠脈造影但未植入支架，60例），對照組（行冠脈造影排外冠心病者，40例），均除外急性心肌梗死

8、，且四組患者性別、年齡、冠心病危險因素（包括高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙等）、藥物服用情況及支架植入情況（再狹窄組和非再狹窄組比較）等基線特征差異無統(tǒng)計學(xué)意義，均臥位采靜脈血10ml，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對標(biāo)本血清進行AT1-AA檢測，相同方法檢測AngⅡ，比較各組間AT1-AA的OD值及陽性率，以及AngⅡ濃度的差別。另選擇門診年輕健康的體檢者15例留靜脈血做AT1-AA檢測的陰性對照。
　　結(jié)果：
　　再狹窄

9、組AT1-AA陽性率（62.0%，31例陽性/50例），明顯高于非再狹窄組（35.0%，21例陽性/60例）、冠心病組（16.7%，10例陽性/60例）、對照組（7.5%，3例陽性/40例），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），再狹窄組OD值與非再狹窄組、冠心病組、對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），非再狹窄組的雖低于再狹窄組，但是與冠心病組及對照組比較，陽性率和OD值偏高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），冠心病組與對照組

10、比較，冠心病組的陽性率及OD值略高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　再狹窄組與非再狹窄組比較AngⅡ差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；再狹窄組、非再狹窄組與冠心病組比較，再狹窄組與非再狹窄組略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；再狹窄組、非再狹窄組與對照組比較，再狹窄組與非再狹窄組較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；冠心病組與對照組比較，冠心病組略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　

11、　1.支架再狹窄組與非再狹窄相比AT1-AA較高，提示AT1-AA可能對PCI術(shù)后再狹窄有影響。
　　2.與未植入冠脈支架組相比，植入支架兩組的AT1-AA較高，提示PCI過程可能導(dǎo)致AT1-AA升高。
　　第二部分：AT1受體自身抗體與動物血管損傷后修復(fù)狀況的研究
　　目的：
　　首先主動免疫大鼠產(chǎn)生AT1-AA,然后行球囊損傷大鼠頸總動脈，并觀察AT1-AA對損傷血管修復(fù)的影響。
　　方法：
　　

12、1.分組：55只大鼠分為4組，A組為AT1-AA組+球囊損傷組，15只，B組為AT1-AA+纈沙坦組+球囊損傷組，15只，C組為單純球囊損傷組，20只，D組為正常對照組，5只。
　　2.主動免疫：AT1多肽與載體偶聯(lián)得到完全抗原，與弗氏完全佐劑混勻乳化后以0.4ug/kg的AT1多肽量于大鼠背部多點皮下注射，對A組、B組進行主動免疫，C組及D組采用等量弗氏完全佐劑大鼠背部多點皮下注射，后每2周對A組、B組進行進行一次強化免疫，采用

13、AT1多肽偶聯(lián)物與弗氏不完全佐劑乳化。
　　3.對B組即AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組自首次免疫開始以2mg/kg/d纈沙坦灌胃至處死。
　　4.大鼠血清AT1-AA的檢測：A組、B組大鼠在主動免疫開始前、之后2周、4周、6周、8周、10周時眼眶采血，應(yīng)用ELISA法檢測大鼠體內(nèi)的AT1-AA滴度。
　　5.于主動免疫6周時建立大鼠左頸總動脈球囊損傷的模型：
　　麻醉大鼠，手術(shù)切開分離頸部皮膚和組織，暴露其左頸

14、總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，自頸外動脈送入經(jīng)修剪的PTCA導(dǎo)絲及1.5*8mmPTCA球囊至左頸總動脈，加壓球囊，并來回抽動，損傷血管內(nèi)膜。以上為A組、B組和C組的操作，D組為正常對照組。
　　6.標(biāo)本取材，處理：
　　D組為正常對照組，5只大鼠于麻醉后解剖分離血管，取出左頸總動脈，大鼠追加麻藥致死，左頸總動脈用0.9%氯化鈉溶液沖洗管腔，分為3段，分別進行HE染色、電鏡檢查、熒光定量PCR(RT-PCR)測定一氧化氮合酶（

15、eNOS）mRNA，以做基礎(chǔ)參照。
　　C組中5只大鼠擬觀察損傷后即刻情況，于球囊損傷后立即取出受損的左頸總動脈，大鼠追加麻藥致死，取出左頸總動脈為球囊損傷即刻標(biāo)本，沖洗后處理同上。
　　A組、B組各15只和C組中剩余15只大鼠，于造模后7天、2周、4周分3批處死大鼠，每組每次5只，取出左頸總動脈（同時取出右側(cè)頸總動脈做對照），沖洗后處理同上。
　　6.1.HE染色
　　觀察染色結(jié)果，測定平均內(nèi)膜面積（IA）、中

16、膜面積（MA）、管腔面積(LA)，計算IA/MA，管腔狹窄率[1-(左頸總動脈管腔面積/右頸總動脈管腔面積)]。
　　6.2.掃描電鏡檢查
　　將標(biāo)本沿縱向剖開，經(jīng)戊二醛和鋨酸雙重固定、梯度乙醇脫水、醋酸正（異）戊酯置換后，于臨界點干燥，經(jīng)離子濺射噴金后用S-3500N型掃描電子顯微鏡掃描觀察，測定內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋情況。
　　6.3.應(yīng)用實時熒光定量PCR(RT-PCR)測定一氧化氮合酶（eNOS）mRNA
　　將組

17、織研磨后經(jīng)RNA提取、反轉(zhuǎn)錄cDNA、熒光定量PCR,由PCR反應(yīng)曲線所得的Ct值，采用△△Ct方法進行相對定量。
　　結(jié)果：
　?。?）大鼠ATI-AA的滴度
　　A組、B組大鼠主動免疫前靜脈血中未檢出AT1-AA，主動免疫2周時，在靜脈血中可檢出AT1-AA，滴度為1：（250±82.3），4周、6周、8周的滴度逐漸升高，10周滴度為1:（7000±2340.5），6周、8周、10周的AT1-AA滴度與2周時相比有

18、顯著差異（P<0．01）,提示主動免疫成功。
　　（2）HE染色結(jié)果
　　球囊損傷即刻，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞完全剝脫。至損傷1周時，AT1-AA+球囊損傷組、AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組、單純球囊損傷組均觀察到新生血管內(nèi)膜形成，管腔則輕度變窄，但三組內(nèi)膜面積（IA），中膜面積（MA）,IA/MA，LA(管腔面積)無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），2周時，鏡下三組內(nèi)膜增厚較前明顯，其中可見較多增生遷移至此的平滑肌細(xì)胞，管腔變小，三組

19、中AT1-AA+球囊損傷組IA，IA/MA最高，LA最小，AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組次之，單純球囊損傷組最輕，比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），中膜差別不大。損傷4周時，各組差異更加明顯，AT1-AA+球囊損傷組IA達(dá)到了0.914±0.024 mm2，IA/MA4.562±0.032，LA為0.048±0.023 mm2，而單純球囊損傷組內(nèi)膜增生最輕，IA為0.336±0.027 mm2，IA/MA1.504±0.030,LA0

20、.138±0.026 mm2，兩組比較有顯著性差異（P＜0.01），AT1-AA+球囊損傷組與AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），三組MA比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各時間點每只大鼠取材時所取右側(cè)頸總動脈標(biāo)本行HE染色，測算平均管腔面積，計算狹窄率[1-(左頸總動脈管腔面積/右頸總動脈管腔面積)]。損傷1周、2周時，AT1-AA+球囊損傷組、AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組、單純球囊損傷組狹窄率比較無統(tǒng)計

21、學(xué)意義，4周時三組的狹窄率分別為70.4%，61.8%，52.3%，比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其與上IA，IA/MA，LA指標(biāo)三組比較的結(jié)果類似。綜上，AT1-AA+球囊損傷組、AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組、單純球囊損傷組三組球囊損傷后新生內(nèi)膜會逐漸增生修復(fù)，三組2周時差異顯現(xiàn)，4周時差異顯著，AT1-AA+球囊損傷組新生內(nèi)膜增生最為明顯，管腔面積最小，狹窄率最高，加入纈沙坦組上述狀況改善明顯，單純球囊損傷組新生內(nèi)膜增生最

22、輕，管腔面積最大，狹窄率最低。提示AT1-AA可使受損血管新生內(nèi)膜明顯增厚，管腔變小，狹窄程度增高，而纈沙坦可部分改善此狀況。
　?。?）電鏡結(jié)果
　　在每個組織標(biāo)本中隨機取5個視野（1.0k）計數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞后取平均值。在1.0k和3.0k的視野中可觀察到球囊處理前后內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生明顯變化，經(jīng)球囊處理后內(nèi)皮細(xì)胞基本消失，證實球囊損傷的比較徹底。在1.0k視野下，可觀察到三組內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)過程，隨著時間推移，各組視野內(nèi)的內(nèi)皮

23、細(xì)胞逐漸增多，內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，損傷1周、2周時，三組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；到4周時，單純球囊損傷組計數(shù)最多，為（46±3.9）個，AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組計數(shù)為（36±5.6），AT1-AA+球囊損傷組計數(shù)為（30±2.7）個，單純球囊損傷組與AT1-AA+球囊損傷組和AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組與AT1-AA+球囊損傷組相比亦有統(tǒng)計學(xué)差異（

24、P＜0.05），提示單純球囊組內(nèi)皮修復(fù)最快，AT1-AA+球囊損傷組修復(fù)最慢，加入纈沙坦，內(nèi)皮修復(fù)改善，可能與纈沙坦拮抗AT1受體，從而抑制了AT1-AA的效應(yīng)有關(guān)。行右側(cè)頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)作為參照，計算1周、2周、4周時的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率（左頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)/右頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)），1周、2周時三組比較差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），4周時，AT-AA+球囊損傷組為64.2%，AT-AA+纈沙坦+球囊損傷組為72.3%，單純球囊

25、組為92.7%，三組兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率與內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)所得出的結(jié)論是一致的。
　?。?）熒光定量PCR檢測eNOSmRNA結(jié)果
　　在球囊損傷即刻，損傷組eNOSmRNA的2-△CT值與正常對照組（未行球囊損傷血管）比較明顯減低，球囊損傷后1周時，A組（AT1-AA組+球囊損傷組），B組（AT1-AA+纈沙坦組+球囊損傷組），C組（單純球囊損傷組）三組2-△CT值仍處于較低水平，隨著時間推移，

26、各組eNOSmRNA逐漸回升，C組升高較快，A組恢復(fù)較慢，4周時，三組差異明顯，其中C組最高，A組最低，B組居中，C組與A組，B組比較均有顯著差異，B組與A組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義，A，B，C三組球囊損傷4周時eNOSmRNA與正常對照相比的相對表達(dá)量（2-△△CT），C組最高，為0.547，仍未達(dá)到正常水平，A組最低，B組居中，提示AT1-AA對eNOSmRNA表達(dá)水平的有影響，可使其恢復(fù)延緩，而在AT1-AA基礎(chǔ)上給予纈沙坦阻斷AT1-

27、AA作用可使這種延緩狀況得到改善。
　　結(jié)論：
　　1.AT1-AA作用于受損血管可使新生內(nèi)膜明顯增厚，管腔變小，從而導(dǎo)致再狹窄，而纈沙坦可明顯改善此狀況；
　　2.基于各組掃描電鏡內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)和計算內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率的差異及eNOS恢復(fù)的差異，提示AT1-AA可導(dǎo)致內(nèi)皮修復(fù)延遲；
　　3.再次證實內(nèi)皮修復(fù)延遲可使新生內(nèi)膜增厚明顯，與再狹窄發(fā)生密切相關(guān)。
　　第三部分：體外實驗AT1-AA對EPCs的影響

28、>　　目的：
　　已知EPCs參與受損內(nèi)皮的修復(fù)過程，EPCs損害會導(dǎo)致內(nèi)皮修復(fù)延遲，最終導(dǎo)致再狹窄。研究提示AngⅡ可以促進EPCs的衰老和凋亡增加，導(dǎo)致其功能下降，AT1-AA與AngⅡ作用類似，但AT1-AA對EPCs影響的研究目前較少，本部分?jǐn)M行體外實驗，觀察AT1-AA對EPCs的影響及機制。
　　方法：
　　1.MTT法檢測EPCs生存活力：
　　應(yīng)用2.5、5和10μM的AT1-AA處理細(xì)胞EPCs

29、24 h，或10μM的AT1-AA處理EPCs3、6、9、12和24 h，MTT法檢測細(xì)胞生存活力檢測，再加入纈沙坦檢測。
　　2.DAPI染色檢測EPCs凋亡情況
　　(2.5、5和10μM)AT1-AA和1μM纈沙坦單獨或復(fù)合處理細(xì)胞， DAPI常溫染色，激光共聚焦電子顯微鏡觀察細(xì)胞核情況。通過觀察20個不同視野計算凋亡小體數(shù)獲得細(xì)胞凋亡率。
　　3.流式細(xì)胞檢測測定EPCs凋亡情況
　　Annexin-V/

30、PI雙染法檢測EPCs凋亡情況。(2.5、5和10μM) AT1-AA和1μM纈沙坦單獨或復(fù)合處理EPCs，用緩沖液（含5μL Annexin V-FITC和2.5μL PI）重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞流式儀測定EPCs凋亡情況。
　　4.活性氧（ROS）水平檢測
　　CM-H2DCFDA細(xì)胞滲透劑檢測細(xì)胞ROS情況。纈沙坦(1μM)預(yù)處理EPCs后再與AT1-AA(10μM)孵育，后細(xì)胞用DCF-DA（20μM）孵育，使用激發(fā)波長

31、488 nm、發(fā)射波長530 nm熒光光譜儀檢測細(xì)胞ROS水平。
　　5.細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測
　　Fluo-4 AM染色檢測 EPCs內(nèi)鈣離子濃度。EPCs中加入纈沙坦(1μM)及AT1-AA(10μM)孵育12 h后再加入Fluo-4 AM25℃孵育30 min，使用激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長522 nm熒光光譜儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。
　　6.鈣蛋白酶活性檢測
　　EPCs細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板中，用鈣

32、螯合劑（BAPT）或鈣蛋白酶抑制劑（calpeptin）處理EPCs1 h，用加入鈣蛋白酶底物（40M）的培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長460 nm熒光光譜儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶活性。
　　7.蛋白免疫印跡
　　Western blot檢測細(xì)胞p-ERK，p-eIF-2α，CHOP，Bcl-2和 Caspase-3蛋白表達(dá)。步驟：1做樣，2 SDS-PAGE凝膠電泳，3蛋白轉(zhuǎn)膜，4接抗體，5顯影。
　　結(jié)

33、果:
　　1.1.AT1-AA可誘導(dǎo)的EPCs生存活力的降低。
　　首先研究AT1-AA對EPCs生存活力的影響。EPCs用2.5、5和10μM的AT1-AA處理24h，或10μM的AT1-AA處理3、6、9、12和24h。結(jié)果顯示AT1-AA能抑制EPCs細(xì)胞的生存活力，并存在劑量與時間上的依賴。同時，AT1-AA有效處理條件（10μM處理12h）被選擇作為進一步研究的條件。然后纈沙坦（0.5、1和2μM）預(yù)處理細(xì)胞24h

34、或1μM預(yù)處理細(xì)胞2、4、6、8、12和24h，同樣獲得纈沙坦的有效處理條件（1μM處理4h）。結(jié)果表明，AT1-AA處理EPCs細(xì)胞，明顯降低了EPCs細(xì)胞的生存活力，而且，纈沙坦預(yù)處理細(xì)胞后，明顯拮抗了AT1-AA誘導(dǎo)的EPCs細(xì)胞生存活力的降低。以上結(jié)果表明，AT1-AA可誘導(dǎo)EPCs生存活力的降低，該效應(yīng)可被纈沙坦抑制。
　　1.2.AT1-AA可誘導(dǎo)的EPCs凋亡及纈沙坦的保護效應(yīng)。
　　為探究AT1-AA誘導(dǎo)的E

35、PCs生存活力的降低是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)及纈沙坦對其的影響，以(2.5、5和10μM)AT1-AA和(1μM)纈沙坦單獨或復(fù)合處理內(nèi)皮祖細(xì)胞，DAPI染色和細(xì)胞流式檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，AT1-AA處理細(xì)胞后，EPCs細(xì)胞染色質(zhì)皺縮，出現(xiàn)凋亡小體，而且凋亡小體比例與AT1-AA存在明顯的劑量依賴。纈沙坦預(yù)處理細(xì)胞后，相比AT1-AA單獨處理細(xì)胞，EPCs細(xì)胞凋亡比例明顯得到逆轉(zhuǎn)。進一步用細(xì)胞流式（Annexin V-FITC/PI雙

36、染）檢測EPCs細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，單獨AT1-AA（10μM，12h）處理細(xì)胞，EPCs細(xì)胞凋亡比例達(dá)到30.3%，纈沙坦預(yù)處理細(xì)胞后凋亡比例明顯得到逆轉(zhuǎn)，降至13.7%。以上結(jié)果表明，AT1-AA可誘導(dǎo)EPCs凋亡致其生存活力降低，而纈沙坦可抑制此效應(yīng)。
　　1.3.AT1-AA誘導(dǎo)EPCs內(nèi)ROS生成，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，促進凋亡，纈沙坦可抑制此作用。
　　研究表明ROS和Ca2+參與細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路，而且

37、在此信號通路中相互關(guān)系密切。為了驗證纈沙坦抑制AT1-AA誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡是通過降低EPCs內(nèi)ROS水平及Ca2+濃度，以纈沙坦(1μM)預(yù)處理EPCs4h，然后AT1-AA(10μM)處理細(xì)胞12h，或者AT1-AA(10μM)單獨處理細(xì)胞6、12和24h。結(jié)果表明，AT1-AA上調(diào)了內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)ROS水平，早在90分鐘的時候，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度就有了明顯提高，而且AT1-AA對內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響存在濃度依賴。與此同時，纈沙坦預(yù)處理內(nèi)皮

38、祖細(xì)胞后，相對AT1-AA單獨處理細(xì)胞，EPCs內(nèi)ROS水平及鈣離子濃度均得到了明顯的逆轉(zhuǎn)。AT1-AA處理EPCs后，我們又對細(xì)胞鈣蛋白酶活性進行了測定，結(jié)果鈣蛋白酶活性明顯增強。纈沙坦預(yù)處理細(xì)胞后，AT1-AA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶活性的增強也同樣得到了逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明，AT1-AA通過升高EPCs內(nèi)ROS的表達(dá)及鈣離子濃度誘導(dǎo)EPCs凋亡，纈沙坦預(yù)處理可降低AT1-AA對EPCs的影響。
　　1.4.AT1-AA誘導(dǎo)EPCs

39、凋亡通過ROS依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，纈沙坦可抑制此效應(yīng)。
　　文獻報道由藥物誘導(dǎo)的ROS水平和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上調(diào)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的激活共同引起了細(xì)胞的凋亡。本部分我們通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白（p-ERK、p-eIF-2α、CHOP、Bcl-2和Caspase-3）的表達(dá)來研究AT1-AA誘導(dǎo)的EPCs凋亡是否通過抑制ROS依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。以AT1-AA(10μM)單獨處理EPCs0.5、1、3、6、9和12h，或者纈沙坦(1μM

40、)預(yù)處理EPCs4h后AT1-AA(10μM)處理12h，結(jié)果表明，AT1-AA單獨處理EPCs，AT1-AA時間依賴性激活了p-ERK1/2，而且處理6h時，p-ERK1/2的表達(dá)就有了明顯的升高，p-ERK、p-eIF-2α、CHOP和Caspase-3蛋白水平的表達(dá)也明顯升高，Bcl-2的表達(dá)明顯降低。纈沙坦預(yù)處理細(xì)胞后，與AT1-AA單獨處理細(xì)胞相比，AT1-AA誘導(dǎo)的p-ERK、p-eIF-2α、CHOP和Caspase-3的

41、升高及Bcl-2的降低均得到了逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明，AT1-AA誘導(dǎo)的EPCs凋亡是通過ROS依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，纈沙坦可抑制此效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1.AT1-AA可誘導(dǎo)ERK的激活從而調(diào)節(jié)p-eIF2α，CHOP，Bcl-2和Caspase-3，升高EPCs內(nèi)ROS的表達(dá)及Ca2+濃度，即通過促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡途徑誘導(dǎo)EPCs凋亡。
　　2.纈沙坦可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡途徑拮抗AT1-AA誘導(dǎo)的EP