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文檔簡介
1、目的:通過RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株Bel-7402,進一步運用體外實驗觀察過表達UCHL1-AS1基因?qū)Ω伟┘毎暝鲋场⒌蛲?、侵襲、遷移能力的影響,最后運用生物信息學(xué)分析UCHL1-AS1相關(guān)蛋白及其蛋白作用網(wǎng)絡(luò)。
方法:
1、按慢病毒轉(zhuǎn)染說明書進行操作,對人肝癌細胞株Bel-7402進行UCHL1-AS1基因過表達轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。將細胞分為三組,分別命名為實驗組(LV-UCHL1-A
2、S1)、陰性對照組(LV-NC)和空白組(Control)進行實驗操作。qRT-PCR方法檢測實驗組、陰性對照組的轉(zhuǎn)染效果。
2、MTT法、平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力;流式細胞技術(shù)比較各組細胞的凋亡情況;Transwell實驗觀察細胞運動能力。
3、運用Starbase2.0在線軟件分析UCHL1-AS1基因及UCHL1基因的相關(guān)蛋白,再通過STRING在線軟件分析其蛋白基因的作用網(wǎng)絡(luò)圖,最后利用DAVID軟件
3、對網(wǎng)絡(luò)圖中相關(guān)基因進行KEGG通路分析和GO富集分析。
結(jié)果:
1、qRT-PCR方法檢測細胞UCHL1-AS1基因在實驗組的表達情況明顯高于陰性組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
2、MTT法結(jié)果顯示實驗組細胞生長速度慢于陰性對照組和空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。平板克隆形成實驗顯示,實驗組細胞克隆形成率(8.0±1.7)%明顯低于陰性對照組(18.7±1.8)%和空白組(19.13±1
4、.19)%的克隆形成率,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.201,P<0.001)。
3、流式細胞技術(shù)結(jié)果,實驗組細胞的凋亡率為(0.51±0.07)%,陰性對照細胞的凋亡率(0.87±0.2)%,空白組細胞的凋亡率(4.95±0.84)%,實驗組和陰性對照組分別與空白組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=72.323,P<0.001),實驗組和陰性對照組相比,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
4、侵襲實驗結(jié)果顯示,實驗組
5、穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)為(10±4.3個),空白組和陰性組分別為(86.3±5.5個)、(79.3±11.9個)。與其他兩組細胞相比,實驗組細胞的侵襲能力減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=83.605,P<0.001)。
5、遷移實驗結(jié)果顯示,實驗組穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)為(52.33±4.36個),空白組和陰性組分別為(97.11±14.41個)、(87.78±4.76個)。實驗組比其他兩組細胞的侵襲能力減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F
6、=20.13,P=0.002)。
6、Starbase v2.0在線軟件分析結(jié)果顯示,elF4Alll基因分別與UCHL1-AS1基因和UCHL1基因存在相互作用。
7、STRING在線軟件作elF4Alll基因和UCHL1基因的蛋白作用網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示:elF4Alll、CWC22、UBC、UPF3A、MAGOH、CASC3、SMG1、UPF1、EIF4G1、RNPS1、UPF3B基因存在相互作用;UCHL1、COP
7、S5、CDKN2A、TP53、UBA52、UBC、USP21、 UCHL1、KRT4、HSPA8、SP90AA1、SNCA基因存在相互作用。
8、elF4Alll基因相關(guān)蛋白KEGG通路分析結(jié)果顯示MAGOH、EIF4A3基因參與剪接體相關(guān)通路的過程,GO分析結(jié)果顯示elF4Alll、CWC22、UBC、UPF3A、MAGOH、CASC3、SMG1、UPF1、EIF4G1、RNPS1、UPF3B基因參與mRNA轉(zhuǎn)錄、mRNA核
8、運輸、細胞大分子分解過程等生物進程,定位于核漿和剪接體等細胞內(nèi),具有RNA結(jié)合、依賴ATP的解螺旋酶活性等分子功能。UCHL1、COPS5、CDKN2A、TP53、UBA52、UBC、USP21、UCHL1、KRT4、HSPA8、SP90AA1、SNCA基因的KEGG通路分析顯示參與膀胱癌、非小細胞肺癌、膠質(zhì)瘤等疾病相關(guān)通路過程,GO分析結(jié)果顯示這些基因參與蛋白去泛素化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因表達調(diào)控等生物進程,定位于細胞中的胞液、細胞器等部位
9、,具備泛素巰基酯酶活性和硫醇酯水解酶活性等分子功能。
結(jié)論:
1.UCHL1-AS1基因可抑制人肝癌細胞株Bel-7402的增殖及侵襲遷移能力,對細胞株凋亡無明顯影響。
2.UCHL1-AS1基因和UCHL1基因分別與elF4Alll基因存在相關(guān)作用。
3.elF4Alll基因與UCHL1基因分別同多個蛋白基因相互作用并構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)圖,對下游基因進行調(diào)控。
4.elF4Alll基因網(wǎng)絡(luò)圖中的
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