藥品微生物控制菌檢查及菌種鑒定-基因分型方法的研究.pdf

1、在科學(xué)技術(shù)日新月異的今天，隨著分子生物學(xué)和微電子技術(shù)的飛速發(fā)展，快速、準(zhǔn)確、特異檢驗(yàn)的微生物新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn)，微生物檢驗(yàn)技術(shù)由培養(yǎng)水平向分子水平邁進(jìn)，并向儀器化、自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化方向發(fā)展，提高了微生物檢驗(yàn)工作的高效性、準(zhǔn)確性和可靠性。但是在藥品檢驗(yàn)領(lǐng)域，微生物鑒定技術(shù)甚少。菌株隨著環(huán)境的變遷不斷發(fā)生著遺傳變異，許多控制菌株在按照標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)時(shí)，周期長(zhǎng)，有時(shí)出現(xiàn)假陰性。目前，中國(guó)藥典逐漸與歐洲藥典、美國(guó)藥典和日本藥局方協(xié)調(diào)一致，在控制菌鑒

2、定方面也做出了“適宜的鑒定方法確證”的要求。因此，獲得適宜的控制菌檢查和鑒定技術(shù)是檢驗(yàn)結(jié)果高效、準(zhǔn)確和可靠的基本保證。
　　銅綠假單胞菌，是臨床常見(jiàn)重要條件致病菌之一，也是藥典收載的局部用藥的重要控制菌，有較高的死亡率。其易定植、易變異和多耐藥，廣泛存在于土壤、水、空氣及人體皮膚、呼吸道與腸道。目前，該菌是藥品、化妝品以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢驗(yàn)中一項(xiàng)重要的微生物控制指標(biāo)。
　　對(duì)于正常樣品來(lái)講，一般需經(jīng)過(guò)滅菌處理，殘存菌株都或多或少受

3、過(guò)不同程度的損傷，要通過(guò)某些培養(yǎng)基復(fù)蘇到能夠被檢出的程度，勢(shì)必需要滿(mǎn)足靈敏度高、起始增菌時(shí)間短、增菌濃度高的要求。雖然藥典明確提出了培養(yǎng)基適用性檢查的必要，但是來(lái)源不同的培養(yǎng)基，即使?jié)M足了中國(guó)藥典或其它標(biāo)準(zhǔn)的基本要求，其靈敏度也有一定差異。
　　由于檢測(cè)儀器的限制，要獲得較多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)工作極其繁瑣，是該類(lèi)微生物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的一個(gè)瓶頸問(wèn)題。傳統(tǒng)鑒別方法日益暴露出種種弊端，越來(lái)越不適應(yīng)消費(fèi)者快餐式的現(xiàn)代消費(fèi)理念。在追求快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)

4、的同時(shí)，更希望結(jié)果的準(zhǔn)確性。本課題以銅綠假單胞菌為典型代表，選擇不同來(lái)源的9株陽(yáng)性菌株和國(guó)內(nèi)外16種培養(yǎng)基利用酶標(biāo)儀在線檢測(cè)OD值繪制生長(zhǎng)曲線的方式，重點(diǎn)探索最適宜的液體增菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，大大減少了工作量，走在了增菌培養(yǎng)基篩選技術(shù)的前沿。同時(shí)對(duì)上述9株陽(yáng)性菌株生化鑒定及分型方法做了進(jìn)一步的探索實(shí)驗(yàn)。
　　目的:采用擇優(yōu)錄取的方式，在一定培養(yǎng)條件下，評(píng)選出優(yōu)質(zhì)、高靈敏度的液體增菌培養(yǎng)基;采用傳統(tǒng)鑒定方法、國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)鑒定技術(shù)、熒光

5、檢測(cè)和基因分型，從而在最直接、最經(jīng)濟(jì)的鑒定與基因分型方法檢驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)隱含的漏檢因素，為藥品、化妝品以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢驗(yàn)提供參考。
　　方法:液體增菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的篩選，通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)曲線圖中關(guān)鍵參數(shù)和綠膿菌素的濃度、菌膜生長(zhǎng)情況對(duì)比情況，擇優(yōu)錄取。將新鮮菌株進(jìn)行傳統(tǒng)方法鑒定、API試劑條鑒定、VITEK2 compact型全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定、血清分型、熒光定量PCR鑒定、RAPD基因分型。
　　結(jié)果:TSB培養(yǎng)基是最符合

6、質(zhì)量要求的一種液體培養(yǎng)基，并且國(guó)內(nèi)外各生產(chǎn)單位提供的產(chǎn)品質(zhì)量差異很小。在35℃培養(yǎng)條件下最適宜的增菌時(shí)間是48小時(shí)，適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)增菌時(shí)間增加陽(yáng)性檢出率，如有必要可以延長(zhǎng)至72小時(shí)。
　　傳統(tǒng)鑒定方法、API試劑條鑒定、VITEK2 compact型全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定、血清分型、熒光定量PCR鑒定，陽(yáng)性檢出率均為100％;RAPD基因分型，陽(yáng)性檢出率為0％。
　　結(jié)論:篩選的TSB培養(yǎng)基，在一定培養(yǎng)條件下，靈敏度高、起始增

7、菌時(shí)間短、增菌濃度高，最適于銅綠假單胞菌的增菌。
　　采用傳統(tǒng)鑒定方法，有時(shí)遇到菌株不同程度表型變異，使綠膿菌素或菌膜的產(chǎn)生時(shí)有時(shí)無(wú)，引起生化試驗(yàn)鑒別反應(yīng)變動(dòng)。因而單純依靠綠膿菌素或菌膜的有無(wú)決定是否進(jìn)一步試驗(yàn)，可能有些片面。API試劑條鑒定和VITEK2 compact型全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定全部檢出陽(yáng)性菌株，鑒定率為100％。API試劑條讀數(shù)受人為因素影響較大，后者則避免了人為誤差，鑒定結(jié)果較為可靠。
　　采用免疫血清

8、結(jié)果的可靠性影響因素較多，除了靈敏度外，還和菌齡、菌株分純程度、使用工具的材質(zhì)及潔凈程度等有關(guān)。操作雖簡(jiǎn)單，但結(jié)果重復(fù)性差。
　　RAPD基因分型技術(shù)需提供的DNA樣本純度高，即對(duì)DNA提取的試劑及試驗(yàn)過(guò)程要求較高。相比之下熒光定量PCR鑒定儀的靈敏度更高些，但直接經(jīng)過(guò)裂解的產(chǎn)物和在有其它相似菌株存在的情況下，特異性還需要進(jìn)一步改進(jìn)。即便是在同一樣本下，廠家提供的和本人做出的檢驗(yàn)結(jié)果有些出入，除了操作誤差外，還和試劑添加比例、試劑