CRH調(diào)節(jié)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和高致死率的特性。腸道炎性疾病是結(jié)腸癌發(fā)病的高危因素，例如患有潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)的病人結(jié)直腸癌的發(fā)病率顯著高于普通人群。CRHⅠ型受體（corticotropin-releasing hormone receptor1，CRHR1）及其配體促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（Corticotropin-releasing hormone，CRH）和優(yōu)洛可定(Uroco

2、rtin，Ucn1)已被證實(shí)對(duì)腸道炎癥具有明確的調(diào)節(jié)作用，但是它們對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響尚不明了。
　　CRH是由41個(gè)氨基酸組成的多肽，它是CRH家族肽中的一員，其他的CRH家族肽包括Ucn1、Ucn2和Ucn3。該家族肽主要是通過(guò)兩種G蛋白耦聯(lián)受體（CRHR1和CRHR2）發(fā)揮生物學(xué)功能，其中CRH主要與CRHR1結(jié)合發(fā)揮作用，它與CRHR1的結(jié)合親和力大約是與CRHR2的20倍，Ucn1與CRHR1和CRHR2均有較高親和力

3、，而Ucn2和Ucn3則只與CRHR2結(jié)合。CRH家族成員最早被發(fā)現(xiàn)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)外界壓力的反應(yīng)。后期發(fā)現(xiàn)它們也廣泛分布于外周組織中并對(duì)許多疾病的炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。近期研究發(fā)現(xiàn)CRH家族肽及其受體對(duì)腫瘤疾病也有調(diào)節(jié)作用，但所報(bào)道作用比較復(fù)雜。已有研究報(bào)道在潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)了CRH及CRHR1的表達(dá)，并且它們?cè)谀c道免疫系統(tǒng)中發(fā)揮促炎作用。此外在葡聚糖硫酸鈉(dextransodium sulfate，DSS

4、)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，研究發(fā)現(xiàn)CRHR1的敲除能明顯改善結(jié)腸炎癥狀況。以上研究表明CRH及其受體CRHR1在腸道炎癥中發(fā)揮著明顯的促炎作用。此外大量的研究證實(shí)CRH家族肽及其受體在心血管系統(tǒng)中也發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)血管通透性、血管生成和血管炎癥。鑒于慢性炎癥、血管生成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，CRH及其受體在腸道系統(tǒng)中的促炎效應(yīng)以及對(duì)血管的調(diào)節(jié)作用提示我們其潛在的促癌作用。因此，本文研究利用小鼠腸炎相關(guān)性腸癌(coliti

5、s-associated cancer，CAC)模型及結(jié)腸癌細(xì)胞系探索CRH及其受體CRHR1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能機(jī)制。
　　第一部分 CRHR1對(duì)小鼠腸炎相關(guān)性腸癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用
　　目的:明確CRHR1對(duì)小鼠CAC發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:利用氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)和DSS兩種藥物誘導(dǎo)建立小鼠CAC模型。通過(guò)免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IH

6、C）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Realtime PCR，qRT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測(cè)CAC小鼠腸道中CRHR1及其配體Ucn1和CRH的表達(dá)。選用CRHR1-/-和CRHR1+/+兩組小鼠建立CAC模型并進(jìn)行觀察對(duì)比。造模期間記錄兩組小鼠的存活率及體重變化。造模結(jié)束后觀察分析兩組小鼠結(jié)腸部位的長(zhǎng)度、腫瘤數(shù)目和大小及腫瘤發(fā)生率。另外對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行組織學(xué)分析，對(duì)炎癥、潰瘍、增生、及

7、損傷面積這四個(gè)方面進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩組小鼠結(jié)腸組織中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。最后利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BRDU)染色檢測(cè)兩組小鼠結(jié)腸部位細(xì)胞的凋亡和增殖水平，通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以及與腫瘤細(xì)胞增

8、殖和凋亡密切相關(guān)的兩種轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducers and activators of transcription，STAT3）的表達(dá)和磷酸化水平。
　　結(jié)果:造模第80天分離結(jié)腸，可見腺癌發(fā)生，CAC造模成功。IHC、qRT-PCR及Western blot結(jié)果顯示CAC小鼠結(jié)腸組織中CRHR1及其配體C

9、RH和Ucn1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著高于正常組小鼠。此外對(duì)比CRHR1+/+和CRHR1-/-兩組造模小鼠，我們發(fā)現(xiàn)在整個(gè)造模期間CRHR1+/+小鼠存活率較低，且體重下降更為明顯。造模80天結(jié)束后，CRHR1+/+小鼠結(jié)腸部位腫瘤數(shù)目、大小及腫瘤發(fā)生率均顯著高于CRHR1-/-造模組。IHC結(jié)果顯示CRHR1+/+造模組中約有70％呈現(xiàn)高級(jí)別異型增生，且其中30％的小鼠可見腺癌發(fā)生，而僅40％的CRHR1-/-造模小鼠觀察到

10、高級(jí)別異型增生且沒有腺癌發(fā)生。組織學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示CRHR1+/+小鼠在炎癥、潰瘍、增生及損傷面積四個(gè)方面的評(píng)分都顯著高于CRHR1-/-小鼠。qRT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)比CRHR1-/-造模小鼠，CRHR1+/+造模小鼠結(jié)腸組織中促炎因子白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-a，TNF-α)的表達(dá)顯著上升而抑

11、炎因子白介素10(interleukin-10，IL-10)的表達(dá)顯著下降。此外TUNEL染色分析發(fā)現(xiàn)CRHR1+/+小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡活動(dòng)顯著低于CRHR1-/-小鼠，而BRDU染色結(jié)果顯示CRHR1+/+小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞增殖活動(dòng)顯著高于CRHR1-/-小鼠。同時(shí)Western blot結(jié)果顯示在CRHR1+/+小鼠結(jié)腸組織中促凋亡蛋白Bc1-2表達(dá)更低而抗凋亡蛋白Bax表達(dá)更高，此外還發(fā)現(xiàn)NF-κB和STAT3的磷酸化水平也顯

12、著高于CRHR1-/-小鼠。
　　結(jié)論:CRHR1的存在對(duì)小鼠CAC的發(fā)生發(fā)展有明顯的促炎和促癌作用。進(jìn)一步的研究顯示CRHR1能夠增加促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)與分泌，此外CRHR1激活NF-κB和STAT3信號(hào)通路并促進(jìn)結(jié)腸組織細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞的凋亡，最終促進(jìn)了CAC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
　　第二部分 CRH對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞促增殖的影響及作用機(jī)制
　　目的:明確CRH對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。

13、　　方法:利用IHC、qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌病人結(jié)腸組織以及結(jié)腸癌細(xì)胞系和結(jié)腸上皮細(xì)胞系中CRH、Ucn1和CRHR1的表達(dá)。以兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系細(xì)胞DLD1和HCT116作為離體研究對(duì)象，給予CRH或CRH合并CRHR1阻斷劑Antalarmin處理，研究CRH/CRHR1信號(hào)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察CRH對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry

14、，F(xiàn)CM)技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)CRH對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。利用qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)CRH處理對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中IL-6表達(dá)的影響。利用Western blott技術(shù)分析具體的信號(hào)機(jī)制，檢測(cè)了CRH對(duì)NF-κB、STAT3、JAK1/2/3和SRC等蛋白的磷酸化水平的影響。對(duì)可能的關(guān)鍵信號(hào)蛋白給以相應(yīng)的抑制劑或siRNA干擾進(jìn)行研究。
　　結(jié)果:IHC結(jié)果顯示結(jié)直腸癌病人結(jié)腸組織中CRHR1及其配體CRH和Ucn

15、1均高表達(dá)于腺癌組織中。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1和HCT116中CRH和CRHR1的表達(dá)顯著高于結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示CRH通過(guò)激活CRHR1能顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性。FMC結(jié)果表明CRH能夠顯著提高G1/S期中的細(xì)胞比例從而促進(jìn)細(xì)胞增殖活動(dòng)，但未見CRH對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞凋亡影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CRH能明顯誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞中IL-6的表達(dá)。此外CRH能夠促

16、進(jìn)NF-κB、JAK2和STAT3磷酸化水平。以上CRH的作用均能被CRHR1特異型阻斷劑Antalarmin所逆轉(zhuǎn)。另外IL-6的中和抗體及小干擾RNA(smal1 interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染能夠明顯抑制CRH誘導(dǎo)的STAT3和JAK2的磷酸化，說(shuō)明IL-6介導(dǎo)CRH對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活。STAT3的抑制劑Stattic能顯著抑制CRH對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的促增殖作用，說(shuō)明CRH對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活動(dòng)的調(diào)節(jié)

17、依賴于STAT3。NF-κB抑制劑CAPE明顯下調(diào)CRH介導(dǎo)的IL-6表達(dá)，說(shuō)明CRH通過(guò)NF-κB促進(jìn)IL-6的表達(dá)。
　　結(jié)論:結(jié)腸癌細(xì)胞中CRH通過(guò)CRHR1促進(jìn)IL-6表達(dá)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路從而影響細(xì)胞周期最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　第三部分 CRH對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響及作用機(jī)制
　　目的:明確CRH對(duì)腫瘤血管生成的影響。
　　方法:通過(guò)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilic

18、al vein vascular endothelialcells，HUVEC)在基質(zhì)膠上的小管形成實(shí)驗(yàn)體外模擬血管生成。利用qRT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)CRH對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系細(xì)胞DLD1和HCT116中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)表達(dá)的影響。通過(guò)NF-κB抑制劑CAPE明確NF-κ

19、B是否參與CRH對(duì)VEGF的調(diào)節(jié)。小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRH處理后的DLD1細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)HUVEC細(xì)胞小管形成能力的影響。通過(guò)VEGF siRNA干擾VEGF的表達(dá)進(jìn)一步研究對(duì)VEGF對(duì)HUVEC細(xì)胞小管形成的影響。
　　結(jié)果:qRT-PCR和ELISA結(jié)果顯示CRH顯著促進(jìn)DLD1細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。且這種促進(jìn)作用被Antalarmin和CAPE抑制。小管形成實(shí)驗(yàn)顯示CRH處理后的DLD1細(xì)胞上清明顯促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的小管形