炎癥微環(huán)境在炎癥性結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵作用及機制解析.pdf

1、背景：慢性炎癥是腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要驅動力。潰瘍性結腸炎是慢性炎癥性腸病的一種主要形式。與正常人群相比，潰瘍性結腸炎病人結腸癌發(fā)生率明顯增高，并且與其炎癥病變的范圍、持續(xù)時間以及病變程度密切相關。免疫細胞的浸潤，炎性因子，趨化因子及其受體，基質金屬蛋白酶等構成的炎癥微環(huán)境對炎癥性結腸癌的發(fā)生發(fā)展起到了關鍵作用。我們前期的實驗結果表明，腫瘤相關中性粒細胞(TANs)經(jīng)CXCR2-CXCL2趨化軸介導，向結腸炎癥部位聚集，促進炎癥性腸癌的發(fā)生

2、和發(fā)展。同時，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在建立的小鼠炎癥性腸癌模型中，結腸部位有大量的成纖維細胞浸潤。據(jù)相關報道顯示，腫瘤相關成纖維細胞作為腫瘤基質的主要成分對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到非常重要的作用，而其在結腸癌中的作用機制還不十分清楚。
　　目的：1.建立小鼠炎癥性結腸癌(CAC)模型，后期給予中性粒細胞表面抗原Ly6G抗體干預，通過阻斷中性粒細胞向病變結腸組織聚集，拮抗炎癥性腸癌的發(fā)展，進一步驗證腫瘤相關中性粒細胞(TANs)在CAC發(fā)生

3、和發(fā)展過程中的關鍵作用。2.探討腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，闡明FGF1/3-FGFR4信號通路在結直腸癌形成過程中的作用機制。
　　方法：1.建立AOM/DSS動物模型，在模型建立第56天，隨機分為兩組，一組連續(xù)7天尾靜脈注射抗中性粒細胞表面抗原抗體Ly6G即治療組，另一組連續(xù)7天尾靜脈注射對照IgG抗體（對照組）。第0、56、67天行乙醚麻醉，脫臼安樂處死小鼠，取結直腸組織保存?zhèn)溆?。qRT-PCR法

4、檢測治療前后CXCL2、CXCR2、MMP-9以及中性粒細胞彈性蛋白酶NE的mRNA水平的變化;用HE染色法檢測治療前后結腸組織結構變化;用免疫熒光染色方法檢測治療前后中性粒細胞浸潤的變化、中性粒細胞彈性蛋白酶NE蛋白水平的變化;用免疫組織化學染色方法檢測治療前后CXCL2、CXCR2、CD31、PCNA、MMP-9蛋白水平的變化。2.用免疫組織化學染色方法檢測CAC模型0、14、28、35、56天時成纖維細胞，巨噬細胞，T淋巴細胞浸潤

5、的動態(tài)變化，血管形成指標MMP-7蛋白水平的變化;qRT-PCR法檢測各階段細胞因子和趨化因子mRNA水平的變化，Western-blot檢測各個階段增殖相關指標p-Erk，Erk蛋白水平的變化。3.體外實驗選取結腸癌病人的正常組織、癌旁組織、癌組織體外分離培養(yǎng)成纖維細胞，qRT-PCR法檢測三種細胞表達的生長因子FGF等mRNA水平的變化;將其上清與結腸癌細胞共培養(yǎng)，Western-Blot檢測Mek/Erk、MMP-7的變化;使用受

6、體FGFR4抑制劑和FGF重組蛋白處理結腸癌細胞，Western Blot檢測上述相關信號分子的表達變化;CCK8及小管形成實驗檢測腫瘤相關成纖維細胞CAFs對血管內皮細胞生長的影響。
　　結果：1.第67天處死小鼠后，與對照組相比較，抗體治療組肉眼可見腫瘤減少(p＜0.01);HE染色鏡下可見，注射Ly6G抗體后，結腸腫瘤的組織形態(tài)及結構有所恢復。2.與對照組相比，治療組結腸組織中性粒細胞的浸潤明顯減少(p＜0.01)、CXCL

7、2，CXCL5和CXCR2的表達明顯降低(p＜0.05)，而且MMP-9表達顯著降低(p＜0.01)，新生血管明顯減少(p＜0.01); NE表達也明顯減少(p＜0.01)，細胞增殖活性顯著下降(p＜0.01)。這些結果提示使用抗中性粒細胞表面抗原抗體可以逆轉結腸癌的發(fā)展。3.在小鼠CAC模型中，成纖維細胞，巨噬細胞和T淋巴細胞的浸潤明顯增強，炎癥因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α在結腸癌形成過程中表達增加(p＜0.05)

8、，此外，CXCL-2及PDGF-α的表達也明顯增加(p＜0.01)。血管形成指標MMP-7(p＜0.01)、增殖相關信號分子p-Erk、Erk表達也顯著增加。4.體外提取成纖維細胞純度達90％以上，腫瘤相關成纖維細胞CAFs高表達FGF1和FGF3(p＜0.05)。將成纖維細胞的上清與結腸癌細胞共培養(yǎng)，與NFs，PFs相比，CAFs可促進結腸癌細胞的增殖，并且與CAFs細胞上清共培養(yǎng)的結腸癌細胞FGFR4自身磷酸化水平(p-Tyrosi

9、ne)、p-Mek/Erk、MMP-7的表達上調，而總FGFR4的表達沒有明顯變化。將成纖維細胞上清與血管內皮細胞共培養(yǎng)，CCK8和小管形成實驗結果顯示，與CAFs細胞上清共培養(yǎng)，可促進血管內皮細胞的增殖和遷移。5.在含有CAFs上清培養(yǎng)的結腸癌細胞中加入FGFR4抑制劑后，p-Tyrosine，p-Mek、p-Erk、MMP-7水平明顯減少。6.在結腸癌細胞中加入重組蛋白FGF-1和FGF-3，Western Blot實驗結果顯示p-