家蠶和蜜蜂中Piwi蛋白基因的克隆與表達譜分析.pdf

1、Argonaute家族蛋白是小RNA介導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體（RISC）中的核心蛋白，能夠結(jié)合小RNA以及剪切靶標基因。其中Piwi亞家族是Argonaute蛋白家族的一個亞支，首先在生殖干細胞中被發(fā)現(xiàn)。2006年，多個實驗室在哺乳動物和果蠅中發(fā)現(xiàn)了與Piwi亞家族蛋白互作的小RNA（piRNA和rasiRNA）。此后，Piwi亞家族蛋白以RISC核心蛋白的身份重新登上研究舞臺。
　　 目前，對Piwi亞家族蛋白的了解仍十分有限，對

2、Piwi亞家族蛋白的研究局限于部分模式生物中，如大小鼠、人、斑馬魚及果蠅。除了果蠅之外，在龐大的昆蟲物種中，對Piwi亞家族的了解幾乎為零。本論文主要研究了重要的經(jīng)濟昆蟲（家蠶和蜜蜂）中Piwi亞家族蛋白的基因結(jié)構(gòu)特征及其表達譜，探討了Piwi亞家族蛋白對昆蟲生殖發(fā)育的作用，為進一步研究昆蟲piRNA及其與Piwi亞家族蛋白互作奠定基礎(chǔ)。
　　 一、家蠶Piwi亞家族蛋白基因克隆與轉(zhuǎn)錄本分析
　　 利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫與

3、已知的Piwi亞家族蛋白，通過同源搜索，預(yù)測得到家蠶的兩個Piwi蛋白基因，命名為siwi1和siwi2。RT-PCR成功擴增出家蠶兩個Piwi基因的部分編碼區(qū)，隨后進一步利用RACE技術(shù)克隆得到了siwi1和siwi2的3’末端。利用EST數(shù)據(jù)庫和電子克隆方法，預(yù)測得到siwi1基因的部分5’UTR、完整的編碼區(qū)和部分3’UTR。RT-PCR成功驗證了這個轉(zhuǎn)錄本的存在?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，siwi1基因的編碼區(qū)含有18個外顯子和17個內(nèi)

4、含子，并且第3個內(nèi)含子是其中最長的一個內(nèi)含子。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，Siwi1蛋白含有Argonaute家族蛋白的特征結(jié)構(gòu)域：PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域，同時預(yù)測得到了3個保守的motif，而這三個motif都在PIWI結(jié)構(gòu)域中。進化分析表明，Siwi1與果蠅Aub和Piwi相似性高，而Siwi2與果蠅Ago3在進化上有著很高的相似性。
　　 二、家蠶Piwi亞家族蛋白表達譜分析
　　 采用實時熒光定量PCR分析家蠶Piwi亞

5、家族蛋白在不同發(fā)育階段和不同組織（頭，馬氏管、絲腺、消化道、精巢和卵巢）中的表達情況。數(shù)據(jù)分析表明，家蠶兩個Piwi亞家族基因在卵中表達量最高。發(fā)育至1齡初孵幼蟲時，兩個Piwi基因的mRNA水平明顯下降，并且在幼蟲階段維持在一個相對較低的水平，發(fā)育至4齡（siwi1）或者5齡（siwi2）幼蟲時表達量達到最低。之后siwi1和siwi2的表達量快速上升，至蛹和成蟲期達到一個較高水平。在六個不同組織中，siwi1和siwi2在精巢和卵巢

6、中高表達，而在馬氏管、絲腺、消化道中表達量明顯減弱。有意思的是，家蠶兩個Piwi亞家族蛋白在頭部的表達量都相對較高，siwi2基因在頭部的表達甚至略高于精巢和卵巢。
　　 三、蜜蜂Piwi亞家族蛋白基因克隆與轉(zhuǎn)錄本分析
　　 通過RT-PCR驗證了預(yù)測的意大利蜜蜂Piwi基因轉(zhuǎn)錄本的存在（分別命名為Am-aub和Am-ago3）。通過RACE技術(shù)分別擴增得到Am-aub和Am-ago3的5’和3’末端，并通過end-en

7、d PCR進行了驗證。同時還擴增得到了多個Am-aub和Am-ago3基因的不同剪切轉(zhuǎn)錄本?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，Am-aub基因共有7個外顯子，而Am-ago3基因有13個外顯子。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，蜜蜂兩個Piwi亞家族蛋白都含有PAZ和PIM結(jié)構(gòu)域。在PAZ結(jié)構(gòu)域中預(yù)測到小RNA的結(jié)合位點，在PIWI結(jié)構(gòu)域中預(yù)測到小RNA的5’結(jié)合位點和剪切催化殘基三聯(lián)體DDH。進化分析表明，Am-aub與家蠶Siwi1相似性最高，而Am-ago3與

8、果蠅Ago相似性最高。
　　 四、蜜蜂Piwi亞家族蛋白表達譜分析
　　 利用實時熒光定量PCR分析了Am-aub和Am-ago3在不同蜂型（工蜂、蜂王和雄蜂）中的表達譜，發(fā)現(xiàn)兩個Piwi基因在雄蜂中的表達量都顯著高于工蜂和蜂王，而蜂王和工蜂的表達差異不顯著。分析Am-aub和Am-ago3在工蜂和蜂王中的變化發(fā)現(xiàn)，在蜂王的幼蟲中，兩個Piwi基因表達量較低，蛹期后表達量迅速升高，化蛹后第2天達到最高點，隨后迅速下降。在