棉蚜氣味結(jié)合蛋白基因克隆和表達(dá)分析.pdf

1、靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)能夠讓昆蟲(chóng)精確地感知環(huán)境中的化學(xué)信號(hào)，進(jìn)而影響昆蟲(chóng)個(gè)體寄主定位、取食、覓偶、交配、尋找產(chǎn)卵場(chǎng)等行為。氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)信號(hào)識(shí)別中具有重要意義。對(duì)這類(lèi)蛋白的深入研究，有助于了解昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別系統(tǒng)的機(jī)理。棉蚜(Aphisgossy piiGlover)是重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。對(duì)多種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗藥性給棉蚜的防控帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。開(kāi)發(fā)新型無(wú)公害有效的棉蚜防治技術(shù)是重要且迫切的需

2、求。本研究利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)AgosOBPs的生化特性、高級(jí)結(jié)構(gòu)、表達(dá)譜等進(jìn)行研究，為開(kāi)發(fā)棉蚜的防控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1、AgosOBPs基因克隆及序列分析
　　本研究以棉蚜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆得到8個(gè)AgosOBPs基因的完整序列。它們編碼141～243個(gè)aa，預(yù)測(cè)分子量為15.745～26.056kDa，在N末端存在由18～24個(gè)氨基酸殘基組成的疏水性信號(hào)肽，平均疏水性為-0.502～

3、-0.071，均屬于親水性蛋白。AgosOBPs具有6個(gè)保守的半胱氨酸Cys殘基，間距模式為C1-X22-28-C2-X3-C3-X37-43-C4-X8-24-C5-X8-C6。3對(duì)由Cys殘基組成的二硫鍵將6個(gè)α螺旋連接起來(lái)，共同支撐著蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。氨基酸同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明AgosOBPs和同翅目蚜科昆蟲(chóng)OBPs的同源性很高。
　　2、棉蚜相對(duì)定量PCR內(nèi)參基因篩選
　　本研究克隆棉蚜7個(gè)候選內(nèi)參基因的全

4、長(zhǎng)或主要片段。運(yùn)用3種統(tǒng)計(jì)算法geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder評(píng)估它們?cè)诓煌蛻B(tài)（有翅型和無(wú)翅型）、寄主寄主（棉花和木槿）、組織（頭、胸、腹、足、觸角）、發(fā)育階段（若蟲(chóng)和成蟲(chóng)期）棉蚜樣品中的表達(dá)穩(wěn)定度。結(jié)果表明PPI和DIMT是不同型態(tài)、取食不同寄主、不同組織棉蚜樣品qPCR數(shù)據(jù)分析的最優(yōu)內(nèi)參基因。PPI、RPII和DIMT是不同發(fā)育階段棉蚜樣品qPCR數(shù)據(jù)分析的最優(yōu)內(nèi)參基因。ACTB和18S

5、rRNA不適合作為棉蚜qPCR內(nèi)參基因使用。
　　3、AgosOBPs在棉蚜體內(nèi)的表達(dá)譜分析
　　運(yùn)用qPCR對(duì)AgosOBPs在不同型態(tài)、取食不同寄主、不同組織（頭、胸、腹、足、翅、觸角）、不同發(fā)育階段棉蚜樣品中的表達(dá)譜進(jìn)行了分析。AgosOBP2、AgosOBP3、AgosOBP6和AgosOBP8在棉蚜若蟲(chóng)初期和成蟲(chóng)末期出現(xiàn)兩個(gè)表達(dá)高峰期，AgosOBP4和AgosOBP7分別在棉蚜1齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)末期出現(xiàn)一個(gè)表達(dá)高峰期

6、。AgosOBP7在觸角中高水平表達(dá)。AgosOBP2在頭部高水平表達(dá)。AgosOBP3和AgosOBP4在腹部高水平表達(dá)。AgosOBP6除在觸角中高水平表達(dá)外，在頭部也具有很高的表達(dá)水平。AgosOBP8在除足、翅外的其他組織中均具有較高的表達(dá)水平。AgosOBP2、AgosOBP6、AgosOBP8在有翅型棉蚜成蟲(chóng)中的表達(dá)量高于無(wú)翅型棉蚜成蟲(chóng)。AgosOBP4在有翅型棉蚜若蟲(chóng)中的表達(dá)量高于無(wú)翅型棉蚜若蟲(chóng)。AgosOBP3和Agos

7、OBP7在無(wú)翅型棉蚜中表達(dá)量高于有翅型棉蚜。AgosOBP2在冬寄主木槿上有翅型棉蚜成蟲(chóng)中的表達(dá)量顯著高于夏寄主上棉蚜。AgosOBP3和AgosOBP6在夏寄主上有翅型棉蚜成蟲(chóng)中的表達(dá)量高于冬寄主木槿棉蚜中的表達(dá)量。AgosOBP4和AgosOBP8在秋蚜和木槿棉蚜中的表達(dá)量較高，AgosOBP7在木槿棉蚜和苗蚜中的表達(dá)量較高。AgosOBP2、AgosOBP3、AgosOBP6、AgosOBP7在夏寄主無(wú)翅型棉蚜成蟲(chóng)中表達(dá)量高于冬寄