家蠶基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMPs及組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP在家蠶中的功能研究.pdf

1、昆蟲在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中對(duì)多變的環(huán)境具備了高度的適應(yīng)能力，這與其神奇的變態(tài)發(fā)育過(guò)程和高效的先天性免疫體系密不可分。加強(qiáng)昆蟲變態(tài)發(fā)育及免疫機(jī)制的研究，對(duì)拓展昆蟲資源的利用和害蟲的綠色防控等有重要的現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)，可為研究人類干細(xì)胞分化、組織器官的形成及免疫機(jī)制提供重要線索。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶家族（Matrix metalloproteinase family,MMPs）是參與昆蟲變態(tài)發(fā)育調(diào)節(jié)和先天性免疫應(yīng)答的一類重要的鋅依賴性內(nèi)肽酶

2、。該家族成員幾乎能夠降解所有種類的細(xì)胞外基質(zhì)，在生物體多種生理和病理過(guò)程中起重要作用，如組織重塑、器官發(fā)育、炎癥調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、創(chuàng)傷修復(fù)及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等。組織金屬蛋白酶抑制劑（Tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs）是MMPs內(nèi)源性的蛋白抑制因子，能夠結(jié)合MMPs并抑制其降解活性，在維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起重要作用。然而，對(duì)果蠅以外其它昆蟲的MMPs和TIMPs功能研究較少。

3、同時(shí)，在不同昆蟲中MMPs和TIMPs的數(shù)目和功能也存在極大差異。因此，全面、深入解析這兩個(gè)家族在昆蟲中的作用具有重要意義。
　　鑒于此，本研究以家蠶（Bombyx mori）為模式，研究了家蠶BmMMPs家族和BmTIMP表達(dá)特征；在體內(nèi)和體外利用基因過(guò)表達(dá)和CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)，探究了BmMMPs家族和BmTIMP在家蠶抵抗家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus,B

4、mNPV）和家蠶變態(tài)發(fā)育中的作用；通過(guò)對(duì)BmMMPs家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究及互作蛋白的鑒定，闡明BmMMPs家族作用的分子機(jī)制。通過(guò)該研究，可為揭示BmMMPs和BmTIMP在家蠶變態(tài)發(fā)育及先天性免疫中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支撐。論文的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1.BmMMPs和BmTIMP基因的鑒定及表達(dá)特征分析
　　本研究在家蠶基因組中鑒定出3個(gè)MMPs家族基因，其中一個(gè)基因包含兩種剪切體，分別命名為BmMMP1a、B

5、mMMP1b、BmMMP2和BmMMP3。同時(shí)鑒定到1個(gè)TIMP基因，命名為BmTIMP。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，家蠶MMP家族基因均包含 MMP家族典型的結(jié)構(gòu)特征，前肽區(qū)（pro-Peptide）、催化結(jié)構(gòu)域（Catalytic domain）、鉸鏈區(qū)（Hinge region）及血紅素蛋白類似區(qū)域（Hemopexin-like C-terminal domain）。系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)家蠶MMP家族聚類于昆蟲MMPs家族一支。BmTIMP包含

6、TIMP家族典型的NTR結(jié)構(gòu)域，且系統(tǒng)發(fā)生分析顯示其同樣與昆蟲TIMP家族聚為一支。家蠶各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征分析發(fā)現(xiàn)，BmMMPs和BmTIMP在化蛹第一天有高量表達(dá)；在五齡三天，BmMMP1、BmMMP3和BmTIMP在中腸和脂肪體中高量表達(dá)，BmMMP2在血液有高量表達(dá)。
　　通過(guò)免疫熒光和蛋白截短實(shí)驗(yàn)對(duì)家蠶MMPs家族和TIMP的亞細(xì)胞定位模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，BmMMP1a&b和BmMMP2的全蛋白及預(yù)測(cè)跨膜區(qū)域的截短蛋白均定

7、位于細(xì)胞質(zhì)中；BmMMP3的全蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，預(yù)測(cè)的核定位信號(hào)區(qū)域定位于細(xì)胞核中，BmMMP3催化結(jié)構(gòu)域的N端影響了其核定位信號(hào)正常行使功能；BmTIMP具有信號(hào)肽區(qū)域，其蛋白部分定位于細(xì)胞質(zhì)中，部分分泌到細(xì)胞外。
　　探究了家蠶MMPs家族基因和TIMP在不同抗原刺激下的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，在BmNPV病毒感染家蠶體外細(xì)胞系和體內(nèi)中腸、血液、脂肪體的過(guò)程中，BmMMPs和BmTIMP在BmNPV病毒感染前期均出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)

8、，隨后表達(dá)量下調(diào)，在感染后期出現(xiàn)極高量表達(dá)；在利用LPS和大腸桿菌刺激家蠶體外細(xì)胞系或體內(nèi)中腸、血液、脂肪體的過(guò)程中，BmMMPs和BmTIMP均有顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。上述結(jié)果表明，BmMMPs和BmTIMP在表達(dá)模式上具有一定的協(xié)同性；BmMMPs和BmTIMP可能參與調(diào)控家蠶的變態(tài)發(fā)育及先天性免疫。
　　2.BmMMPs和BmTIMP的相互作用鑒定
　　本部分通過(guò)雙熒光共定位、熒光雙分子互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（BiFC）及免疫共沉淀

9、實(shí)驗(yàn)（Co-IP），分析了BmMMP1a、BmMMP2和BmMMP3三個(gè)蛋白與BmTIMP蛋白之間的相互作用關(guān)系。雙熒光共定位結(jié)果顯示，BmMMPs均能分別與BmTIMP共定位于細(xì)胞質(zhì)中；BiFC結(jié)果顯示，BmMMPs都能與BmTIMP發(fā)生相互作用，并且都聚集于細(xì)胞質(zhì)中；Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BmMMP1s分別與BmTIMP之間同樣存在特異性的相互作用。上述結(jié)果表明，家蠶MMPs家族三個(gè)蛋白與TIMP都具有相互作用，推測(cè)BmTIMP可

10、能通過(guò)直接結(jié)合BmMMPs抑制其活性。
　　3.BmMMPs和BmTIMP對(duì)BmNPV侵染的影響
　　本部分通過(guò)在體外家蠶細(xì)胞系BmNS-SWU1中分別創(chuàng)制BmMMPs和BmTIMP基因的過(guò)表達(dá)及CRISPR/Cas9基因敲除模型，在體外水平探索BmMMPs和BmTIMP對(duì)BmNPV侵染的影響。結(jié)果顯示，BmMMPs基因過(guò)表達(dá)和BmTIMP基因敲除可以顯著增強(qiáng)BmNPV的增殖復(fù)制；BmMMPs基因敲除和BmTIMP基因過(guò)表達(dá)

11、可以顯著抑制BmNPV的增殖復(fù)制。
　　同時(shí)，利用IV型膠原（Collagen-IV）降解實(shí)驗(yàn)、MMPs的廣譜性抑制劑BB-94、GM6001和BmMMPs蛋白活性區(qū)域截短實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究了家蠶MMPs活性對(duì)BmNPV病毒侵染的影響。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)BmMMP1a、BmMMP2和BmMMP3的截短活性區(qū)域均能夠增強(qiáng)家蠶細(xì)胞對(duì)Collagen-IV的降解；BB-94和GM6001能夠顯著抑制BmNPV的增殖復(fù)制；相對(duì)于BmMMPs全

12、蛋白，其截短活性區(qū)域能顯著增強(qiáng)BmNPV的在家蠶細(xì)胞中的增殖復(fù)制。上述結(jié)果表明，BmMMPs可能以活性形式參與調(diào)控BmNPV病毒的增殖復(fù)制。
　　4.轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)BmMMP3和BmTIMP對(duì)BmNPV增殖及家蠶變態(tài)發(fā)育的影響
　　利用顯微注射技術(shù)創(chuàng)制了BmMMP3和BmTIMP過(guò)表達(dá)家蠶品系，在體內(nèi)水平探究BmMMP3和BmTIMP對(duì)BmNPV增殖及家蠶變態(tài)發(fā)育的影響。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因品系的表型統(tǒng)計(jì)和BmNPV感染后的致死率和病

13、毒關(guān)鍵基因分析，發(fā)現(xiàn)BmMMP3過(guò)表達(dá)品系相對(duì)于正常品系表現(xiàn)為體型增大、體重增加，且BmNPV在BmMMP3-OE品系中的感染能力被顯著增強(qiáng)；BmTIMP過(guò)表達(dá)品系具有發(fā)育遲緩、幼蟲期全部致死及不能正常上簇等表型。這些結(jié)果表明，BmMMP3和BmTIMP能夠參與調(diào)控家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育；在體內(nèi)過(guò)表達(dá)BmMMP3能夠顯著增強(qiáng)BmNPV的增殖復(fù)制。
　　5.轉(zhuǎn)基因敲除BmMMPs家族基因?qū)mNPV增殖及家蠶變態(tài)發(fā)育的影響
　　利用C

14、RISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合的方法，創(chuàng)制了單獨(dú)過(guò)表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶品系Cas9-OE，以及單獨(dú)過(guò)表達(dá)sgRNA靶標(biāo)序列的轉(zhuǎn)基因家蠶品系BmMMP1-sgRNA、BmMMP2-sgRNA和BmMMP3-sgRNA共4種轉(zhuǎn)基因品系。隨后，利用Cas9-OE與BmMMPs-sgRNA雜交敲除目的基因的方法，獲得MMPs基因特異性敲除的三個(gè)雜交敲除品系BmMMP1-KO、BmMMP2-KO和BmMM3-KO。通

15、過(guò)對(duì)BmMMPs-KO品系生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的表型統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmMMP1-KO出現(xiàn)發(fā)育遲緩、幼蟲和蛹期致死，影響氣管的延伸和分枝。BmMMP2-KO具有發(fā)育遲緩、蛾期生存活力不高、不能正常交配，雌蛾下顎和側(cè)胞保持凸出、被毛易脫落、腹部積水、卵發(fā)育異常及馬氏管發(fā)育異常等多種表型，雄蛾除不具有側(cè)胞保持凸出和卵發(fā)育異常外，其它與雌蛾表型一致。BmMMP3-KO品系具有發(fā)育遲緩、幼蟲期致死、蛾期活力不高、雌蛾不能產(chǎn)卵等表型。同時(shí)，將BmNP

16、V病毒利用口服和注射的方法感染家蠶BmMMPs-KO雜交敲除品系和正常品系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmMMPs-KO雜交敲除品系能夠顯著抑制VP39基因的轉(zhuǎn)錄。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，BmMMPs在家蠶的變態(tài)發(fā)育和調(diào)控BmNPV侵染中起重要作用。
　　6. BmMMPs和BmTIMP作用機(jī)制的探究及相互作用蛋白的鑒定
　　通過(guò)在家蠶細(xì)胞中單獨(dú)過(guò)表達(dá) BmNPV增殖關(guān)鍵基因IE1、FGF、GP64和VP39，檢測(cè)對(duì)BmMMPs和BmTIMP的

17、轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除VP39未檢測(cè)到顯著誘導(dǎo)外，IE1、FGF、GP64都對(duì)BmMMPs和BmTIMP具有一定的誘導(dǎo)活性。基于BmMMPs和BmTIMP在表達(dá)模式上具有很高的一致性，通過(guò)在家蠶細(xì)胞中單獨(dú)過(guò)表達(dá)BmMMPs和BmTIMP各個(gè)基因，探究其是否存在相互調(diào)控關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmMMPs和BmTIMP之間均具有相互誘導(dǎo)活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在家蠶細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BmMMPs可以顯著誘導(dǎo)Caspase3、7和9的活性，敲除BmMMPs可

18、以抑制Caspase3、7和9的活性。上述結(jié)果進(jìn)一步暗示了，BmMMPs和BmTIMP參與家蠶抵御BmNPV侵染的調(diào)控；BmMMPs和BmTIMP之間可能存在相互調(diào)控關(guān)系。
　　通過(guò)免疫共沉淀的方法，并借助質(zhì)譜分析技術(shù)，分別以BmMMP1a和BmMMP3為誘餌蛋白，從家蠶BmN-SWU1細(xì)胞中篩選并鑒定到6個(gè)與BmMMP1a互作的蛋白，6個(gè)與BmMMP3互作的蛋白。經(jīng)初步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，ATP synthase與BmMMP1a存在相互作