殼寡糖微生物源酶法制備及其對HSC-HPC影響的研究.pdf

1、本文以酶法制備殼寡糖為目標(biāo)，通過篩選目的菌株、發(fā)酵條件和酶性質(zhì)研究、酶法制備產(chǎn)物純化分析等一系列過程得到殼寡糖。然后，利用制備得到的殼寡糖進(jìn)行細(xì)胞試驗，考察殼寡糖在體外環(huán)境下對小鼠骨髓細(xì)胞以及造血干/祖細(xì)胞(HSC/HPC)的影響，探討殼寡糖是否具有促進(jìn)小鼠HSC/HPC增殖、分化的能力。 1.在選擇性培養(yǎng)基中篩選得到目的菌株BSF114，對該菌株進(jìn)行鑒定的過程中采用了分子方法和形態(tài)學(xué)方法相結(jié)合、先分子后形態(tài)學(xué)的鑒定思路，確保

2、了鑒定結(jié)論的可靠性。在分子生物學(xué)法鑒定中，選取內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)作為擴(kuò)增對象，經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示該菌為煙曲霉(A.fumigatus)。這一鑒定結(jié)果與后續(xù)形態(tài)學(xué)結(jié)果一致，這也同時證明ITS1可單獨(dú)用于對煙曲霉的鑒定。對此菌株的鑒定工作驗證了以上思路的可行性并擴(kuò)充了ITS1區(qū)域在真菌分類應(yīng)用中的例證，為真菌鑒定工作提供一定的參考。 2.通過對菌株BSF114發(fā)酵產(chǎn)酶條件和酶性質(zhì)的研究，得到從發(fā)酵到酶解反應(yīng)整個過程中

3、各主要條件如下：(1)發(fā)酵產(chǎn)酶條件液體搖瓶培養(yǎng)基組成為：1％的殼聚糖粉、蛋白胨0.5％、酵母膏0.1％、0.2％K2HPO4、0.1％MgSO4，初始pH5.0，搖瓶培養(yǎng)36小時。(2)酶解反應(yīng)條件為：50℃，pH4，反應(yīng)體系中添加0.25％MnC12的激活劑。 3.殼寡糖酶法制備結(jié)果顯示：酶解反應(yīng)12小時為最佳酶解時間。在對殼寡糖進(jìn)行分離純化的過程中，嘗試對殼寡糖粗品應(yīng)用凝膠SephadexG-25進(jìn)行分離純化。試驗中采用電

4、導(dǎo)率、還原糖測定相結(jié)合的方法，對待分離物中的目的組分進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定位，這大大簡化了純化后對殼寡糖的分析工作。經(jīng)HPLC分析，表明該純化方法可對殼寡糖進(jìn)行有效純化，同時此過程也為殼寡糖后續(xù)細(xì)胞活性研究提供了材料。 4.試驗中運(yùn)用細(xì)胞免疫磁珠分離和流式細(xì)胞檢測等技術(shù)，研究殼寡糖在體外條件下對小鼠骨髓細(xì)胞以及造血干/祖細(xì)胞的影響。結(jié)果表明：殼寡糖在高濃度條件下對小鼠骨髓有明顯的促進(jìn)增殖的作用。用殼寡糖對基質(zhì)細(xì)胞和造血干/祖細(xì)胞共培