大腸桿菌操縱子改造及其應用初步研究.pdf

1、代謝工程中的核心之一是代謝途徑的調(diào)控。原核生物大多數(shù)基因以操縱子的形式存在，功能相關(guān)的基因及調(diào)控序列形成一個轉(zhuǎn)錄單元。操縱子是原核生物基因基因調(diào)控的最重要的機制。而啟動子是DNA上RNA聚合酶的結(jié)合位點，是轉(zhuǎn)錄的起始位點，在基因的表達過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。啟動子的與RNA聚合酶的結(jié)合強度以及其與各種轉(zhuǎn)錄因子的相互作用直接影響下游基因的轉(zhuǎn)錄水平以及在細胞內(nèi)的表達水平。操縱子是基因表達調(diào)控的重要機制，而啟動子是操縱子中的重要生物學元件，

2、本實驗從操縱子結(jié)構(gòu)以及啟動子在操縱子中的分布對基因表達的調(diào)控作用進行了初步研究。
　　 在低拷貝質(zhì)粒pCL1920上，構(gòu)建了一個無啟動子調(diào)控的綠色熒光蛋白編碼基因(gfp)和β-半乳糖苷酶編碼基因(lacZ)組成的操縱子，操縱子5端有一個啟動子克隆區(qū)域，便于快速克隆目的啟動子。利用該操縱子，可以綠色熒光蛋白和β-半乳糖苷酶作為信號分子監(jiān)測啟動子的啟動強度，即其在轉(zhuǎn)錄水平對操縱子中下游基因的調(diào)控作用。為啟動子改造提供了分子生物學工

3、具，并利用該系統(tǒng)成功克隆了大腸桿菌內(nèi)fie、katE、spc、rpoS、nlpD啟動子以及代謝工程中常用的trc啟動子的核心區(qū)域，同時表征了上述啟動子在體內(nèi)的啟動下游基因表達特性。根據(jù)綠色熒光蛋白和β-半乳糖苷酶的表達水平，F(xiàn)ic，katE啟動子啟動強度較弱，而spc、rpoS、nlpD啟動子較強，其中trc啟動子的核心區(qū)域的啟動能力最強，上述不同強度的啟動可適用于在代謝工程中外源基因不同的表達水平。另外，利用操縱子中兩個報告基因探索了

4、操縱子中多拷貝啟動子以及基因間啟動子對基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用。通過化學合成五個重復拷貝的trc核心區(qū)啟動子MTre并將MTrc克隆在上述操縱子中，其啟動強度是單拷貝trc核心區(qū)啟動子強度的3.47倍；通過整合PCR得到trc、spc啟動子串聯(lián)的trc-spc啟動子，并將trc-spc啟動子克隆在上述操縱子中，其啟動強度強于trc和spc分別單拷貝的啟動強度。通過增加操縱子中的啟動子拷貝數(shù)可以增加下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，啟動子結(jié)構(gòu)中轉(zhuǎn)錄必須序

5、列較編碼基因更小，因此，增加啟動子的拷貝數(shù)可以以最小的代謝負擔增加基因的表達水平，為代謝工程中基因的精確調(diào)控的分子生物學元件研究提供分子生物學工具。
　　 將4-羥基丁酸代謝途徑中三個關(guān)鍵基因克隆在lac啟動子下游，構(gòu)建一個非天然存在的由琥珀酸到4-羥基丁酸代謝途徑操縱子，利用產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌株QZllll和XLl Blue△sdhA以葡萄糖為發(fā)酵底物積累聚-3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸共聚物。探索該合成操縱子在大腸桿菌中