禽致病性大腸桿菌lsr操縱子調(diào)控作用研究.pdf

1、禽致病性大腸桿菌（Avain Pathogenic Escherichia coli，APEC）能引起禽類嚴重的呼吸道和全身性感染，由于其廣泛的耐藥性、復雜的血清型和致病機制，一直制約對該菌的有效防控。
　　密度感應(yīng)（Qurom Sensing，QS）是細菌通過分泌自誘導物（Autoinducer，AI），并以此進行“交流”，監(jiān)控群體密度，進而協(xié)調(diào)基因表達，調(diào)控多種生物功能的過程。LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陰

2、性和陽性菌中，通過產(chǎn)生 AI-2信號分子實現(xiàn)對不同種屬細菌的生理功能調(diào)控。
　　在鼠傷寒沙門氏菌中，AI-2對細菌生理功能的調(diào)控是通過lsr操縱子（包含8個基因，分別是 lsrK、lsrR、lsrA、lsrC、lsrD、lsrB、lsrF、lsrG）對 AI-2的轉(zhuǎn)運、內(nèi)化實現(xiàn)的，而在 APEC中尚未見相關(guān)研究，因此，研究lsr操縱子對AI-2的轉(zhuǎn)運、內(nèi)化的機制，為從QS層面開展對APEC的防控提供新思路。
　　本研究開展了

3、如下研究：
　　1.大腸桿菌MG6155ΔlsrB的構(gòu)建及AI-2內(nèi)化檢測MG1655ΔlsrB
　　利用Red同源重組法，構(gòu)建大腸桿菌MG1655的lsrB缺失株MG1655ΔlsrB。運用哈維弧菌BB170菌株對野生株MG1655與缺失株MG1655ΔlsrB的AI-2內(nèi)化動力學進行檢測，結(jié)果lsrB缺失后，MG1655不能完全內(nèi)化AI-2，表明在MG1655中，lsr操縱子在AI-2內(nèi)化、轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，也為研

4、究APEC中l(wèi)sr操縱子是否具有類似功能提供重要依據(jù)。
　　2. APEC中l(wèi)sr操縱子同源序列檢測
　　為探討APEC中是否存在lsr操縱子，依據(jù)大腸桿菌MG1655的lsr操縱子序列，設(shè)計8對引物對APEC O1、O2、O78三個血清型共60株分離株進行PCR檢測。其中，在22株APEC O78血清型中，lsr操縱子檢出率為95.5％；在16株APEC O1血清型分離株中，lsr操縱子檢出率為68.8%；在22株APEC

5、 O2血清型分離株中，lsr操縱子檢出率為40.9%。
　　對APEC O1、O2、O78三個血清型lsr操縱子的檢測結(jié)果表明，參與AI-2內(nèi)化的lsr操縱子在APEC菌株中的分布具有血清型相關(guān)型，在APEC O78血清型中檢出率最高，而O2血清型最低。3. APEC的LsrB與AI-2結(jié)合驗證
　　以APEC菌株APEC94（血清型為O78）研究對象，對包含8個基因的lsr操縱子進行測序。將APEC94的lsr操縱子序列與

6、MG1655中l(wèi)sr操縱子序列進行分析。結(jié)果表明，其核苷酸同源性為99%。大腸桿菌MG1655的lsrB基因能編碼AI-2受體蛋白，為了研究是否APEC中的lsrB基因具有類似功能，本研究構(gòu)建了pCold TF-LsrB表達載體，分別以BL21(DE3)和BL21?luxS(DE3)為宿主菌對APEC的LsrB重組蛋白進行表達、純化。
　　AI-2結(jié)合試驗表明，BL21?luxS(DE3)表達的 LsrB重組蛋白具有結(jié)合 AI-2

7、的活性，結(jié)合的AI-2分子可通過對蛋白的熱變性進行釋放。AI-2釋放試驗表明，BL21(DE3)表達的LsrB重組蛋白能結(jié)合內(nèi)源性（自身產(chǎn)生）的AI-2，能夠通過對蛋白熱變性釋放結(jié)合的AI-2。
　　本研究結(jié)果表明APEC94的LsrB蛋白具有AI-2結(jié)合活性，因此推測在APEC中，具有LsrB樣AI-2結(jié)合受體。
　　4. APEC的lsr操縱子缺失株構(gòu)建及生物學特性分析
　　利用同源重組法構(gòu)建了APEC94的lsr

8、操縱子缺失株APEC94Δlsr（Cm），并對野生株和缺失株的生物學特性進行研究。
　　結(jié)果表明，缺失株與野生株相比，其生長曲線及生物被膜形成能力無明顯差異（P﹥0.05）。對9日齡櫻桃谷鴨的半數(shù)致死量測定結(jié)果表明，野生株與缺失株的 LD50分別為8.66×105和2.55×108 CFU，缺失株毒力下降了約294倍。對9日齡櫻桃谷鴨以1.0×109 CFU劑量分別用野生和缺失株進行攻毒，24 h后缺失株和野生株在雛鴨血液中載菌量

9、分別為2.5×104和6.5×102 CFU/mL（P﹤0.0001）；肝臟內(nèi)載菌量分別為5.9×108和3.6×105 CFU/mL（P﹤0.0001）；脾臟內(nèi)的載菌量分別為1.9×1010和6.0×105 CFU/mL（P﹤0.0001）；腎臟內(nèi)的載菌量6.1×108、8.1×105 CFU/mL（P﹤0.0001）。表明缺失lsr操縱子后，APEC對宿主的致病性顯著降低，推測lsr操縱子對APEC的致病性具有重要的調(diào)控作用，具體調(diào)