枯草桿菌rib操縱子結(jié)構(gòu)基因在ccpA位點(diǎn)的表達(dá).pdf

1、核黃素是重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，在醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前，核黃素工業(yè)生產(chǎn)方法主要是采用重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵法。在解除了枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑的反饋抑制后，核黃素操縱子的表達(dá)水平是影響核黃素合成速率和最終產(chǎn)量的關(guān)鍵因素?？梢圆捎脴?gòu)建游離型和整合型的重組質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)核黃素操縱子的過(guò)量表達(dá)，但是，游離質(zhì)粒固有的不穩(wěn)定性，以及整合質(zhì)粒需要使用抗生素不斷選擇所帶來(lái)的環(huán)境安全問(wèn)題，使這種技術(shù)方法存在缺陷。CcpA蛋白是枯草芽孢桿菌的

2、一種全局調(diào)控蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞的碳分解代謝物阻遏。CcpA蛋白的缺失可以在一定程度上解除碳分解代謝物阻遏效應(yīng)，而有利于核黃素的合成。從功能上判斷，ccpA基因應(yīng)該是組成型表達(dá)，其啟動(dòng)子應(yīng)屬于中強(qiáng)啟動(dòng)子。利用ccpA基因的表達(dá)元件表達(dá)核黃素操縱子的結(jié)構(gòu)基因，既可以實(shí)現(xiàn)核黃素操縱子的過(guò)量表達(dá)，又可以缺陷CcpA蛋白，解除碳分解代謝物阻遏對(duì)核黃素合成的抑制，是一種構(gòu)建高產(chǎn)核黃素基因工程菌的簡(jiǎn)便、多效的方法。 本文以產(chǎn)核黃素的重組菌B.s

3、ubtilis24為出發(fā)菌株，首先采用同源重組方法對(duì)其recA基因的缺陷進(jìn)行了恢復(fù)，得到B.subtilis24 X1。搖瓶培養(yǎng)結(jié)果顯示，B.subtilis24 X1的生長(zhǎng)速率和最大生物量均高于B.subtilis24，核黃素合成能力提高了25％。 對(duì)ccpA基因表達(dá)元件進(jìn)行的序列分析和比對(duì)顯示，其啟動(dòng)子具有中強(qiáng)啟動(dòng)子的特征，SD序列和終止子序列都與共同序列十分接近，屬于強(qiáng)表達(dá)元件。 采用重疊PCR方法，將ccpA