核苷酸類藥物與小分子或蛋白質(zhì)相互作用的共振瑞利散射光譜及其分析應用研究.pdf

1、共振瑞利散射(RRS)與共振非線性散射(RNLS)是二十世紀九十年代發(fā)展起來的新的分析技術(shù)。因其靈敏度高，實驗設備簡單，且方法快速簡便而越來越受到人們的關(guān)注。而且生物大分子的研究和測定方面更表現(xiàn)了它的優(yōu)越性，但是目前該技術(shù)對核苷酸及煙酰胺輔酶這類生物小分子的研究甚少。因此，本文以核苷酸及輔酶為主要的研究對象，研究它們與金屬離子和染料的相互作用。發(fā)展了用RRS法測定某些核苷酸和輔酶新方法。同時也研究了某些輔酶與生物大分子蛋白質(zhì)之間的作用，

2、發(fā)展了RRS法與RNLS法測定輔酶，蛋白質(zhì)的新方法。文中還利用共振瑞利散射光譜，結(jié)合吸收光譜和熒光光譜的變化對相關(guān)反應機理進行了探討。 1．鈰(Ⅳ)與腺嘌呤核苷酸相互作用的共振瑞利散射光譜研究及其分析應用。 用共振瑞利散射光譜研究了Ce(Ⅳ)與腺苷-5’—一磷酸(AMP)、腺苷-5’—二磷酸(ADP)、腺苷-5’—三磷酸(ATP)等腺嘌呤核苷酸之間的相互作用。結(jié)果表明，在pH2.0-3.0左右的Walpole緩沖溶液中，

3、Ce(Ⅳ)及核苷酸自身的共振瑞利散射(RRS)均十分微弱，當它們相互作用形成復合物后將導致RRS顯著增強并出現(xiàn)新的RRS光譜。不同的腺嘌呤類核苷酸與Ce(Ⅳ)結(jié)合產(chǎn)物具有相似的RRS光譜特征，最大散射峰均位于358nm處并于540nm附近有一較小的散射峰，但散射強度有一定的差異，其相對散射強度順序為AMP＞ADP＞ATP。在一定范圍內(nèi)，腺嘌呤核苷酸濃度與散射強度成正比，檢出限分別為2.08ngmL-1(AMP)、2.28ngmL-1(A

4、DP)和3.63ngmL-1(ATP)，據(jù)此建立了一種以Ce(Ⅳ)離子為探針RRS法測定腺嘌呤核苷酸的新方法。本文討論了Ce(Ⅳ)和腺嘌呤核苷酸反應的最佳條件及影響因素，實驗了共存物質(zhì)的影響，表明方法有較好的選擇性。文中還探討Ce(Ⅳ)與ATP的結(jié)合模式及散射增強的原因。 2．煙酰胺輔酶與維多利亞藍4R相互作用的吸收、熒光和共振瑞利散射光譜及其分析應用研究。 在pH7.2的Britton—Robinson(BR)緩沖溶液

5、中，輔酶Ⅰ(NAD+)、輔酶Ⅱ(NADP+)、還原型輔酶Ⅰ(NADH)和還原型輔酶Ⅱ(NADFH)等煙酰胺輔酶與陽離子染料維多利亞藍4R(VB4R)之間能通過靜電引力和疏水作用力形成電中性離子締合物，此時不僅能引起維多利亞藍4R的褪色反應，而且能導致共振瑞利散射(RRS)顯著增強和NADH的熒光猝滅。其最大褪色波長均位于611nm處，但褪色程度的順序是NADPH＞NADH＞NADP+＞NAD+。4種輔酶反應產(chǎn)物也具有類似的RRS光譜特征

6、，最大散射波長分別位于521nm(NAD+，NADP+)，524nm(NADH)，526nm(NADPH)。但它們的相對散射強度有較大的差異，并以NADPH＞NADH＞NADP+＞NAD+的順序降低。不論吸光度降低(△A)或散射增強(△I)均在一定范圍內(nèi)與輔酶的濃度成線型關(guān)系。這就為用褪色分光光度法和RRS法測定這類輔酶，特別是還原型輔酶創(chuàng)造了條件。文中重點討論了反應體系的RRS光譜特征，用RRS法測定輔酶的適宜條件和影響因素，并考察了

7、共存物質(zhì)對測定的影響，表明方法有良好的選擇性。據(jù)此發(fā)展了一種用RRS技術(shù)高靈敏測定這類輔酶的新方法。文中還結(jié)合吸收光譜和熒光光譜的變化對反應機理和散射增強的原因進行了討論。 3．鈀(Ⅱ)—輔酶—木瓜蛋白酶反應體系共振瑞利散射法測定某些煙酰胺輔酶。 在pH4.4-4.6的Britton—Robinson(BR)緩沖溶液中，輔酶Ⅰ(NAD+)，輔酶Ⅱ(NADP+)及還原型輔酶NADH和NADPH四種煙酰胺類輔酶能與Pd(Ⅱ)

8、能形成1：1的螯合物，當它們進一步與木瓜蛋白酶反應形成1：1：1的三元復合物時，能引起共振瑞利散射(RRS)顯著增強并出現(xiàn)新的RRS光譜。4種反應產(chǎn)物具有相似的RRS光譜特征，在300-600nm之間有一個寬的散射帶，并在309nm和550nm附近有兩個散射峰。在一定濃度范圍內(nèi)，散射增強(△I與輔酶的濃度成正比，反應具有高靈敏度。對于不同輔酶的檢出限在(2.35-3.33)×10-8molL-1之間，可用于微量煙酰胺類輔酶的測定。本文研

9、究了適宜的反應條件和影響因素，考察了共存物質(zhì)的影響，表明方法有較好的選擇性。據(jù)此發(fā)展了一種用RRS技術(shù)靈敏，簡便和快速測定上述輔酶的新方法。 4．鈀(Ⅱ)與還原型輔酶Ⅰ和溶菌酶相互作用的熒光和共振瑞利散射光譜研究。 在pH4.6BR緩沖溶液中，NADH與Pd(Ⅱ)和溶菌酶結(jié)合后，不僅能引起溶菌酶熒光光譜的顯著猝滅，更能導致共振瑞利散射(RRS)的顯著增強。最大RRS波長位于309nm，其RRS增加程度與NADH的含量呈正

10、比，對NADH的線性范圍在(0.26-31.25)×10-7molL-1之間，最低檢出限可達5.7ngmL-1。而當NADH過量時，RRS的增加程度與溶菌酶的濃度在(0.035-4.2)×10-7molL-1的范圍內(nèi)呈正比，對溶菌酶的檢出限可達15.1ngmL-1。RRS光譜為研究生物分子與金屬配合物之間相互作用提供了新的信息，也為高靈敏測定這些生物大分子與小分子創(chuàng)造了條件。文中還通過考察溶菌酶在NADH與Pd(Ⅱ)存在下所發(fā)生的熒光猝

11、滅，以及NADH在溶菌酶及Pd(Ⅱ)存在下所發(fā)生的熒光猝滅，研究了它們的熒光猝滅類型，并探討了Pd(Ⅱ)與NADH及溶菌酶的結(jié)合模式及反應機理。 5．鈀(Ⅱ)—NADP與幾種蛋白質(zhì)體系的共振瑞利散射光譜和共振非線性散射光譜及其分析應用。 在pH4.0-5.0的Britton—Robinson(BR)緩沖溶液中，NADP與Pd(Ⅱ)能形成螯合陰離子，它能進一步與牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血紅蛋白(HG

12、B)及γ—球蛋白(γglobin)相互作用，引起共振瑞利散射(RRS)、二級散射(SOS)和倍頻散射(FDS)不同程度的增加。其增加強度為牛血清白蛋白＞人血清白蛋白＞血紅蛋白＞γ—球蛋白。4種蛋白質(zhì)的反應產(chǎn)物有相似的散射光譜特征，最大的RRS，SOS，F(xiàn)DS波長分別位于333nm，500nm，250nm附近。在一定范圍內(nèi)，散射強度的增加(△IRRS，△ISOS，△IFDS)與各種蛋白質(zhì)濃度的增加均有很好的線型關(guān)系，可用于幾種蛋白質(zhì)的定量