復合膠原-rhBMP-2殼聚糖微球的3D打印多孔羥基磷灰石支架的制備及其異位成骨研究.pdf

1、第一部分、香草醛交聯(lián)rhBMP-2/殼聚糖微球的制備及其對間充質干細胞的影響研究
　　背景:RhBMP-2是一種重要的骨誘導活性蛋白，它在體內具有很強的誘導骨組織生成的能力。而既往的研究表明rhBMP-2在體內的釋放模式對其誘導成骨的作用具有重要的影響， rhBMP-2早期的突釋結合后期的持續(xù)釋放較短時間大劑量釋放能夠更高效的誘導骨組織生成。殼聚糖是一種來源廣泛的天然生物材料，具有良好的生物相容性，它可作為許多細胞因子的緩釋載體。

2、同時香草醛與傳統(tǒng)的交聯(lián)劑（戊二醛等）相比生物相容性更好。因此用香草醛為交聯(lián)劑有可能制備出生物相容性更好，且具有良好緩釋性能的rhBMP-2/殼聚糖微球。
　　目的:以香草醛為交聯(lián)劑來制備rhBMP-2/殼聚糖微球，明確該微球在體外rhBMP-2的緩釋性能，并且明確微球緩釋的rhBMP-2對骨髓間充質干細胞的影響。
　　方法:利用乳化交聯(lián)法來制備包載rhBMP-2的殼聚糖微球，用電鏡觀察微球的形態(tài)。以微球浸提液為實驗組，以空白

3、培養(yǎng)基為對照組來培養(yǎng)人間充質干細胞，以檢測微球的細胞毒性和對細胞增殖的影響。用動態(tài)浸泡的方法來檢測rhBMP-2的體外釋放特征。通過比較緩釋3天和7天獲取的微球緩釋液與空白培養(yǎng)基對細胞ALP表達的影響，來反應緩釋的rhBMP-2是否具有生物活性。
　　結果:所制備的殼聚糖微球呈球狀。將微球浸提液與人間充質干細胞培養(yǎng)24及48小時，兩個時間點實驗組與對照組OD值無顯著性差異(24h:0.719±0.072比0.726±0.051,p

4、＞0.05;48h:1.192±0.108比1.273±0.058,p＞0.05)。將浸提液與細胞培養(yǎng)1、3和7天，實驗組和對照組細胞數(shù)量均逐漸增多，且每個時間點實驗組與對照組OD值無明顯差異。5mg微球在體外釋放19天，rhBMP-2逐漸釋放，第19天檢測濃度仍達到216.14±20.00ng/mL。緩釋3天與7天組間充質干細胞ALP活性分別為:(0.504±0.065)、(0.684±0.060)μmolpNPP/min/mg pr

5、otein，均顯著高于空白培養(yǎng)基組(0.135±0.011)（p＜0.05）。
　　結論:用香草醛為交聯(lián)劑制備的rhBMP-2微球具有良好的生物相容性，能夠達到緩釋rhBMP-2的目的，且在制備過程中仍能保持rhBMP-2的生物活性。
　　第二部分、膠原/rhBMP-2殼聚糖微球修飾的多孔HA支架的制備及體外生物相容性研究
　　背景:隨著快速成形技術的發(fā)展，目前許多材料可通過三維打印技術制備出個性化的骨修復材料，由于它

6、是增材制造技術，因此能夠實現(xiàn)對材料內部結構的精細控制。目前通過該技術可制備出內部孔隙高度貫通的骨修復支架，然而單純依靠結構的改變很難實現(xiàn)大塊骨修復材料內部骨組織的充分長入。因此良好的骨組織工程支架還需要具備一定的骨誘導活性。將骨誘導活性蛋白與多孔骨組織工程支架相結合，從而構建出同時具備骨誘導性和骨傳導性的支架材料有可能成為大塊骨缺損修復的良好選擇。
　　目的:通過三維打印技術制備多孔HA支架，并對支架進行膠原/rhBMP-2殼聚糖

7、微球涂層修飾，從而構建出同時具備骨誘導活性和骨傳導性的復合多孔HA支架，并且在體外驗證復合支架的生物相容性。
　　方法:用計算機建立多孔支架的三維模型，然后用擠壓成形系統(tǒng)制備多孔HA支架，并進行微波熱處理。分別對支架進行膠原涂層(HC)和膠原/rhBMP-2殼聚糖微球涂層(HCC)構建復合支架。用環(huán)境掃描電鏡分別觀察HA、HC及HCC支架的表面形貌。用人骨髓間充質干細胞來檢測所合成支架的細胞毒性以及對細胞增殖的影響。將人骨髓間充質

8、干細胞滴加到支架的表面，觀察不同復合支架表面粘附細胞的差異。通過動態(tài)浸泡的方法來檢測HCC支架中rhBMP-2體外釋放的方式。將支架分別浸泡1、3和7天后，收集浸提液，檢測浸提液中rhBMP-2對細胞ALP活性的影響，從而間接的反應復合材料中rhBMP-2的活性。
　　結果:通過電鏡觀察結果顯示3D打印的HA支架表面可形成膠原涂層，并且將rhBMP-2殼聚糖微球滴加到支架后，在支架的表面可見有微球的粘附，且部分微球發(fā)生團聚現(xiàn)象。支

9、架浸提液細胞毒性實驗結果顯示所合成的支架在24小時和48小時兩個時間點，HCC組浸提液細胞活性與HC、HA及空白組相比無明顯差異。將細胞與支架混合培養(yǎng)1、3和7天結果顯示各個時間點每組間細胞數(shù)量都逐漸增加，且在每個時間點各個組間細胞數(shù)量無明顯差異。細胞粘附實驗結果顯示hMSCs可粘附于多孔支架表面，且HCC支架表面粘附的細胞數(shù)較其他組多。體外釋放實驗結果顯示，HCC支架表面rhBMP-2的釋放可持續(xù)3周以上，且每個時間點測得的rhBMP

10、-2濃度都高于112.8ng/ml。ALP活性檢測結果顯示所釋放的rhBMP-2仍可誘導hMSCs細胞ALP活性增加。
　　結論:膠原/rhBMP-2殼聚糖微球涂層是將rhBMP-2與三維打印HA支架進行復合的良好方法，所構建的復合支架具有良好的生物相容性且能夠長時間的緩釋有活性的rhBMP-2。它在體外可以良好的支持人骨髓間充質干細胞的增殖和粘附。
　　第三部分、膠原/rhBMP-2殼聚糖修飾的多孔HA支架的體內誘導異位成

11、骨研究
　　背景:骨修復材料與宿主骨的緊密結合是防止內植物松動，移位或者疲勞性斷裂的重要保證。單純的多孔材料可通過調節(jié)材料的孔隙率或者表面改性增加細胞粘附等方式提高材料的骨傳導性。然而對于大塊骨修復材料，單純依靠增加骨傳導性來達到骨組織向材料內部生長的方法作用有限。如何讓復合材料具備誘導組織細胞向成骨細胞分化，而實現(xiàn)自身誘導成骨的能力，是大塊骨修復材料的研究熱點。
　　目的:比較單純的HA支架、經(jīng)膠原涂層的HC支架以及膠原/

12、rhBMP-2殼聚糖微球修飾的多孔HCC支架在兔肌袋內的埋植后支架內部組織生長的差異。明確經(jīng)rhBMP-2殼糖微球修飾的支架內部骨組織分布的情況。
　　方法:用新西蘭大白兔股四頭肌肌袋作為異位成骨的模型。實驗分3組:HA、HC及HCC組。于每只兔子右后肢作長1cm切口，并制備股四頭肌肌袋模型，分別將支架埋入肌袋內，每組8只，于4周和8周時取出標本，用硬組織切片機制備組織切片，并用VG染色后觀察組織生長情況。用micro-CT對標本

13、進行掃描分析，明確骨組織生長情況。用mimics軟件進行骨組織三維重建，觀察所形成的骨組織大體觀。
　　結果:植入8周時組織樣本的大體觀可見，HCC支架表面的軟組織較為致密且與材料粘附緊密，而HA及HC組周圍的軟組織較為疏松容易從支架上脫落。HCC支架micro-CT觀察結果顯示4周時骨體積分數(shù)為11.56％，而到了8周時則為17.14％。隨著植入時間的延長，骨小梁的厚度(4周:0.074±0.05mm;8周:0.083±0.05

14、mm)和骨量(4周:4.69±1.09mm3;8周:7.12±1.56mm3)都逐漸的增大。標本的硬組織切片觀察結果顯示HA及HC組支架內部主要由纖維組織和脂肪組織充填而無新生的骨組織，而HCC組支架的表面可見有新生的骨組織生成，且骨組織由內向外較均勻的粘附于支架的孔壁上，且4周較8周時骨小梁的厚度增加。三種支架孔隙內均可見到有新生的血管組織生成。
　　結論:本研究所制備的膠原/rhBMP-2殼聚糖微球涂層支架可有效的在體內誘導骨