紅樹植物耐鹽基因的克隆與分析.pdf

1、植物受鹽堿和水分脅迫時，細胞質中積累大量有機滲透調節(jié)劑，如甘露醇、海藻糖、甜菜堿和脯氨酸等，而將細胞質中的無機滲透調節(jié)劑(主要是K+)擠向液泡，使胞質與細胞(液泡)外環(huán)境維持滲透平衡，這樣就避免了細胞質高濃度無機離子對酶和代謝的毒害。除維持細胞的正常膨壓外，甜菜堿還具有無毒滲透保護劑的作用，能夠穩(wěn)定復雜蛋白質高級結構，從而使得許多代謝過程中的重要酶類在滲透脅迫下繼續(xù)保持活性。 甜菜堿是以膽堿為底物經(jīng)兩步酶催化氧化生成，催化第二步

2、反應的是甜菜堿醛脫氫酶(betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)。甜菜堿脫氫酶是一個限速酶，甜菜堿的增加與它的活性有關，因此BADH基因的有效表達可增強植物的耐鹽性。自1981年從高等植物中首次分離得到BADH基因后，對BADH基因的研究報告陸續(xù)有報道。目前，已經(jīng)先后從大腸桿菌、酵母以及多種高等植物中克隆到BADH基因的cDNA。據(jù)推測，單子葉植物的BADH基因可能位于微體中，而雙子葉植物BADH基因位于

3、葉綠體中。 本文對紅樹植物BADH基因的克隆與分析進行了初步的探索，主要結果如下： 1、采用CTAB法提取白骨壤總RNA，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳和OD260與OD280的檢測，結果顯示，28S rRNA條帶亮度是18S rRNA條帶亮度2倍以上，而且OD260/OD280值非常接近2.0，表明我們提取的白骨壤總RNA完整性較好，基本上沒有發(fā)生降解；純度較高，所含雜質很少，可用于后續(xù)實驗中RT—PCR的進行。 2

4、、以提取的白骨壤總RNA為模板，用反轉錄酶反轉錄生成cDNA，利用簡并引物，通過遞減PCR(Touch down PCR)技術擴增出約250bp的BADH基因核心片段。經(jīng)過比對，它和已報道的白骨壤BADH基因同源性高達80％。 3、根據(jù)擴增得到的白骨壤BADH基因片段設計引物，分別進行3’RACE和5’RACE，擴增白骨壤BADH基因未知的3’端和5’端，并分別得到約350bp(3'RACE)和1.0kb(5’RACE)的特異性

5、片段。測序和比對后，證實我們成功地擴增到了白骨壤BADH基因的3’端和5’端。 4、在以上實驗基礎上，重新設計白骨壤BADH基因特異性引物，從白骨壤總RNA反轉錄生成的cDNA中擴增得到一條約1.5kb的特異性條帶。經(jīng)過測序和比對后，進一步確定成功克隆到白骨壤的BADH基因。BADH基因編碼區(qū)全長1509bp，編碼502個氨基酸。對BADH基因的分析發(fā)現(xiàn)，它與已報道的白骨壤BADH基因的同源性均在90％以上。 5、用T4