異源宿主中蛋白質內(nèi)含子剪接活性的定向進化.pdf

1、蛋白質內(nèi)含子(intein)是存在于宿主蛋白質前體中的一段多肽序列。它能夠催化自身從蛋白質前體中剪切下來，同時將兩側多肽序列以肽鍵相連。這種翻譯后的加工過程稱為蛋白質剪接(protein splicing)。蛋白質內(nèi)含子自主催化的剪接反應為蛋白質的合成和加工提供了新的途徑，因而在蛋白質工程及其它領域中具有廣泛的應用前景。但是目前所發(fā)現(xiàn)的天然蛋白質內(nèi)含子數(shù)量有限，而且大部分在非天然宿主中的剪接活性顯著降低，因此限制了蛋白質內(nèi)含子的開發(fā)和利

2、用；同時由于對蛋白質內(nèi)含子結構與剪接功能之間的關系仍不十分了解，因此很難通過理性設計和改造來提高蛋白質內(nèi)含子的剪接活性。
　　 本研究以具有極低剪接活性的蛋白質內(nèi)含子為實驗材料，利用定向進化策略，最終達到提高其在異源宿主中剪接活性的目的。首先對來自Trichodesmium erythraeum的DnaB-1、RIR1-3和DnaE-3蛋白質內(nèi)含子(TerDnaB-1、Ter DnaE-3、Ter RIR1-3)以及來自Cryp

3、tococcus neoformans AD血清型的PRP8蛋白質內(nèi)含子(Cne-AD PRP8)進行改造，分別獲得各自的人工型微小蛋白質內(nèi)含子和斷裂蛋白質內(nèi)含子，然后利用麥芽糖結合蛋白(meltosebinding protein，MBP)和硫氧還蛋白(thioredoxin)組成的檢測系統(tǒng)對各蛋白質內(nèi)含子在大腸桿菌中的剪接活性進行檢測。結果表明Ter DnaE-3和Cne-AD PRP8人工型蛋白質內(nèi)含子在大腸桿菌中具有較高的剪接活

4、性，Ter DnaB-1和TerRIR1-3則幾乎沒有剪接活性。結合本實驗室對其他蛋白質內(nèi)含子的研究結果，選擇Ter DnaE-1和Ter，DnaE-2人工型微小蛋白質內(nèi)含子(簡稱為TE1-m和TE2-m)進行蛋白質剪接活性的定向進化研究。定向進化策略采用易錯PCR(error prone PCR)構建相應的突變庫，然后利用依賴卡那霉素抗性所建立的蛋白質剪接篩選系統(tǒng)進行快速有效的篩選，即將TE1-m和TE2-m的編碼序列插入卡那霉素抗性

5、基因中，造成卡那霉素抗性基因編碼的磷酸轉移酶(phosphotransferase)失活。蛋白質內(nèi)含子經(jīng)過進化后發(fā)生剪接，磷酸轉移酶恢復原始的結構和活性，從而能夠在含有一定濃度卡那霉素的平板上生長。本研究共進行三輪篩選：第一輪在卡那霉素濃度為5μg/ml的平板上篩選，共獲得20個陽性突變體；第二輪在卡那霉素濃度為10μg/ml的平板上篩選，共獲得11個陽性突變體；第三輪在卡那霉素濃度為20μg/ml的平板上篩選，沒有獲得陽性突變體。所獲

6、得的突變體均利用Western印跡對其蛋白質剪接活性進行鑒定。實驗結果表明經(jīng)過兩輪易錯PCR，有效突變積累后，獲得一個剪接活性明顯提高的突變體pK⊿TE2-⊿G。該突變體中有三處突變，其中兩處分別是TE2-m的第52位氨基酸(由Ile變?yōu)镻he，I52F)和第100位氨基酸(由Pro變?yōu)镾er，P100S)；第三處是載體上-1位氨基酸，即與TE2-m的N端相連的第一個氨基酸，由Ala變?yōu)镚ly(A-1G)。進一步的研究表明這三處突變共同