堿性植酸酶的定向進(jìn)化及其在不同宿主中的表達(dá).pdf

1、植酸酶能水解植酸及植酸鹽，被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑。堿性植酸酶具有較高的熱穩(wěn)定性、底物特異性及抗蛋白酶降解能力，不僅能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求，而且能適應(yīng)動物腸道環(huán)境，是一種理想的飼料添加劑。但是，相對酸性植酸酶而言，堿性植酸酶最大的缺點是酶活較低，且在酸性環(huán)境中酶活受到嚴(yán)重抑制。因此，本研究首先通過定向進(jìn)化的方法提高堿性植酸酶在酸性及中性條件下的酶活;然后通過比較正向突變體在三種不同宿主菌（大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌）中的定向進(jìn)化規(guī)律

2、及酶學(xué)性質(zhì)，從而獲得具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的重組菌株。
　　通過分子克隆的手段從枯草芽孢桿菌168（Bacillus subtilis168）中獲得一個堿性植酸酶，并在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)其異源表達(dá)。通過比較不同的表達(dá)方式，最終確定了用于下一步定向進(jìn)化的重組菌構(gòu)建和誘導(dǎo)條件，即以pET30a為表達(dá)載體、酶切位點為BglⅡ和XhoⅠ、去除植酸酶基因中的信號肽序列、誘導(dǎo)表達(dá)溫度為25℃。
　　然后以野生型堿性植酸酶基因為模板、以大

3、腸桿菌BL21為表達(dá)宿主，通過兩輪的定向進(jìn)化、組合突變及飽和突變，獲得了D24G、D24G/K70R/K111E/N121S、D24G/K265N等正向突變體。在37℃、pH7.0反應(yīng)條件下，上述三株突變體的酶活比野生型分別提高了40.35％、52.06％、55.22％;在37℃、pH4.5反應(yīng)條件下，則分別提高了76.61％、121.05％、84.21％。本研究考察了上述三種突變體的酶學(xué)性質(zhì)，包括最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)

4、定性及動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示突變體和野生型具有相同的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性，但三種突變體的溫度穩(wěn)定性均高于野生型;37℃、pH7.0反應(yīng)條件下的總催化效率(kcat/Km)依次為野生型的2.32、2.31、2.10倍;而37℃、pH4.5反應(yīng)條件下則分別是1.98、2.63、2.15倍。
　　最后將酶活差距較大的突變體D24G、S51A、K265E、S51A/K265E、D24G/K70R/K111E/N121S及野

5、生型在畢赤酵母GS115和枯草芽孢桿菌WB800N中實現(xiàn)分泌性表達(dá)。通過比較該堿性植酸酶的不同突變體在三種表達(dá)體系中的催化特性與酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)三種表達(dá)體系的定向進(jìn)化規(guī)律基本一致，在大腸桿菌中表達(dá)時酶活高的突變體在畢赤酵母GS115和枯草芽孢桿菌WB800N中一般也相應(yīng)較高。與大腸桿菌相比，在畢赤酵母中表達(dá)的野生型和突變體的酶活及最適反應(yīng)溫度均有所降低，D24G的最適反應(yīng)溫度從60℃降到55℃，而S51A則從60℃降到50℃，推測是由畢赤

6、酵母中的糖基化現(xiàn)象引起?？赡苡捎诒狙芯恐械膲A性植酸酶基因來源于枯草芽孢桿菌，在枯草芽孢桿菌WB800N中表達(dá)時，突變體及野生型的酶活均有一定幅度的增加，37℃、pH7.0反應(yīng)條件下，枯草芽孢桿菌表達(dá)的突變體D24G酶活比在大腸桿菌中表達(dá)時提高了68.32％;而且D24G的最適反應(yīng)溫度從60℃上升到65℃。綜上所述，枯草芽孢桿菌更適合用于此堿性植酸酶突變體的表達(dá)及工業(yè)化生產(chǎn)。
　　本文通過定向進(jìn)化方法得到了在酸性及中性條件下酶活提高