人源性飼養(yǎng)層制備的標(biāo)準(zhǔn)化操作.pdf

1、人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)自發(fā)現(xiàn)以來一直以其不斷自我更新和分化多潛能性特點(diǎn)吸引著眾多關(guān)注的目光。長期穩(wěn)定的得到未分化狀態(tài)hESCs克隆是進(jìn)行各項(xiàng)研究的前提。以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制作飼養(yǎng)層(mouse Feeder cells以下簡稱鼠飼養(yǎng)層)共培養(yǎng)的方法得到hESCs歷史最為悠久，也正因如此，它們的穩(wěn)定性得到了更多的認(rèn)可。然而，使用最為普遍的鼠飼養(yǎng)層是不符合臨床應(yīng)用的要求的，真正實(shí)

2、現(xiàn)hESCs的臨床應(yīng)用就不能使用動物來源的飼養(yǎng)層，為此人類胚胎成纖維細(xì)胞(human embryonicfibroblasts．hEFs)制備的飼養(yǎng)層(以下簡稱人飼養(yǎng)層)成為我們目前的最佳選擇。要長期進(jìn)行大中型hESCs培養(yǎng)就必須先有穩(wěn)定的飼養(yǎng)層制作工藝和足夠量的人成纖維細(xì)胞。本研究針對人源性飼養(yǎng)層制作過程中出現(xiàn)的問題進(jìn)行了初步研究，并由此為依據(jù)建立了標(biāo)準(zhǔn)化的人飼養(yǎng)層制備流程。 目的： 1.采集人成纖維細(xì)胞，用于人飼養(yǎng)層

3、的制備； 2.針對本室人飼養(yǎng)層制作過程中出現(xiàn)的問題進(jìn)行研究：是否一定需要使用動物血清；成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)的生長曲線中各期(滯后期，對數(shù)生長期，平臺期，衰退期)制備飼養(yǎng)層的效果如何；飼養(yǎng)層密度對hESCs培養(yǎng)效果有沒有影響，不同個(gè)體來源的成纖維細(xì)胞制備的飼養(yǎng)層有無差異。為標(biāo)準(zhǔn)化制備流程的建立提供依據(jù)； 3.建立標(biāo)準(zhǔn)化人飼養(yǎng)層制備程序，為hESCs在人飼養(yǎng)層體系下的長期培養(yǎng)提供指導(dǎo)。 材料和方法： 實(shí)驗(yàn)材料

4、來自2-4個(gè)月的自愿放棄妊娠的人工流產(chǎn)完整胚胎。(長沙市婦幼保健醫(yī)院提供)采用機(jī)械分離方法從胚胎采集皮膚和肌肉，通過組織塊培養(yǎng)分離hEFs，然后胰酶消化進(jìn)行傳代擴(kuò)增。收集的不同胚胎個(gè)體來源的每株hEF細(xì)胞，通過細(xì)菌，衣原體，支原體培養(yǎng)以及支原體hoechst33258染液染色進(jìn)行微生物污染檢測。此外，每株hEF細(xì)胞還進(jìn)行了核型檢測，并且在培養(yǎng)到p7時(shí)進(jìn)行絲裂霉素處理制作飼養(yǎng)層，然后在這些飼養(yǎng)層上種植chHES 20和chHES 22克隆

5、，D/F ES(參見后文)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液，6天后進(jìn)行AKP染色檢測克隆的分化情況，以確定收集到的hEF細(xì)胞株是否適用于制備飼養(yǎng)層。針對本實(shí)驗(yàn)室以往在人飼養(yǎng)層體系中培養(yǎng)hESCs出現(xiàn)的問題，進(jìn)行以下研究： 1.以hi-DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，針對胎牛血清(Fetal Bovine Serum．FBS)及其可能的替代產(chǎn)品：人血清白蛋白(Human Serum Albumin．HSA)、血清替代補(bǔ)充成分(Synthesis Ser

6、um Subtituent，SSS)對hEF-dly-2 p7擴(kuò)增效率的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較，選擇其中最適的培養(yǎng)體系； 2.以chHES 20和chHES 22克隆分化率為指標(biāo)，研究傳代后hEF-dly-2 p7在體外培養(yǎng)的生長曲線中各期(滯后期，對數(shù)生長期，平臺期，衰退期)制備飼養(yǎng)層的效果； 3.以chHES 20和chHES 22克隆分化率為指標(biāo)，在利用hEF-dly-2p7制作飼養(yǎng)層的過程中尋找一個(gè)最佳飼養(yǎng)層鋪皿密度；

7、 4.比較在3株不同胚胎個(gè)體來源的飼養(yǎng)層(mitc hEF-dly-2 p7，mitc hEF-dly-8 p7，mitc hEF-dly-9 p7)上培養(yǎng)的clfftES 20和chHES 22克隆分化率是否有差異。 結(jié)果： 共采集到hEF細(xì)胞10株，均沒有細(xì)菌，支、衣原體污染。其中9株能夠進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增，并且這9株細(xì)胞均能在制成飼養(yǎng)層后支持chHES 20和chHES 22克隆的生長。 1.在FBS,H

8、SA,SSS作為培養(yǎng)基添加物進(jìn)行hEF的培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)添加10﹪HAS，10﹪SSS，20﹪SSS的培養(yǎng)體系下，hEF根本無法擴(kuò)增，添加10﹪FBS的培養(yǎng)體系仍然是最佳選擇； 2.傳代后hEF-dly-2 p7在體外培養(yǎng)至指數(shù)生長期結(jié)尾時(shí)，用來制作飼養(yǎng)層效果最好，hESCs克隆分化率僅為1.7±2.3﹪； 3.D/F ES培養(yǎng)基的常規(guī)體系下培養(yǎng)hESCs，人飼養(yǎng)層的最佳細(xì)胞鋪皿密度為3×10<'4>個(gè)/cm<'2>；

9、 4.在不同株次來源的飼養(yǎng)層上生長的hESCs克隆分化率差別不大。 附：人源性飼養(yǎng)層制備的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。 結(jié)論： 截止本文完成時(shí)，已采集到10株不同標(biāo)本來源的人胚胎皮膚來源的成纖維細(xì)胞，其中有一株由于數(shù)量太少沒有進(jìn)行研究，其余9株均符合飼養(yǎng)層制作要求。如果凍存對細(xì)胞的壽命沒有影響，每株細(xì)胞經(jīng)過擴(kuò)增和凍存可供本室現(xiàn)規(guī)模的人源性飼養(yǎng)層制作至少26年； 1.尚未找到合適的FBS替代物，但是在ESCs克隆種植

10、前使用磷酸緩沖溶液(phosphate-buffered saline，PBS)對飼養(yǎng)層進(jìn)行洗滌可以清除FBS。 2.以本室常用的1∶20比例進(jìn)行傳代擴(kuò)增時(shí)，hEF-dly-2 p7需要10天的時(shí)間經(jīng)歷滯后期(1天)，指數(shù)生長期(5天)，平臺期(4天)最后到達(dá)衰退期，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明hEF-dly-2 p7指數(shù)生長期結(jié)束時(shí)，制作的飼養(yǎng)層效果最好，因此在hEF在制備飼養(yǎng)層前應(yīng)擴(kuò)增6天。 3.D/F ES培養(yǎng)基的常規(guī)體系下，人飼

11、養(yǎng)層細(xì)胞鋪皿密度對hESCs的培養(yǎng)影響很大：密度過稀或者過密都將導(dǎo)致hESCs克隆嚴(yán)重分化，密度過稀時(shí)，hESCs克隆細(xì)胞從中央開始變形，細(xì)胞呈扁平狀，核質(zhì)比變?。贿^密時(shí)，hESCs克隆變厚，細(xì)胞從克隆周邊開始堆積，最后中央細(xì)胞變形分化。 4.在隨機(jī)挑選的三株不同胚胎個(gè)體來源的飼養(yǎng)層上生長的hESCs克隆分化率差別不大。說明通過本研究使用的方法得到的hEF性質(zhì)穩(wěn)定，都能較好地支持hESCs的生長。 通過規(guī)范人源性飼養(yǎng)層制