腎上腺髓質(zhì)素對人牙髓干細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　當(dāng)齲病進(jìn)展侵犯到牙髓時，牙髓可以通過形成修復(fù)性牙本質(zhì)來保護(hù)牙髓的健康。DPSCs現(xiàn)在被認(rèn)為是修復(fù)性牙本質(zhì)形成的一個重要來源，DPSCs具有多向分化的潛能，目前的研究認(rèn)為成牙本質(zhì)分化對于牙髓損傷后修復(fù)性牙本質(zhì)的形成起到關(guān)鍵作用。然而目前DPSCs的增殖及分化機(jī)制尚未完全確定。研究顯示，ADM在牙齒的發(fā)育過程中，在關(guān)鍵的發(fā)育時間點(diǎn)呈現(xiàn)高表達(dá)，并且ADM對成骨現(xiàn)象存在明顯的調(diào)控作用，而成骨和成牙本質(zhì)具有很多的相似性。本課題組

2、通過前期檢測離體牙牙髓組織的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于正常牙髓，牙髓損傷組織ADM明顯呈高表達(dá)，并且表達(dá)部位集中于損傷牙髓部位和修復(fù)性牙本質(zhì)周圍。因此本課題組推測ADM可能對DPSCs的增殖分化具有一定的調(diào)節(jié)作用。
　　本研究旨在:（一）檢測ADM在齲病牙髓組織內(nèi)的表達(dá)情況以及ADM和齲壞程度的相關(guān)性。（二）體外分離、培養(yǎng)、鑒定原代DPSCs。（三）通過在DPSCs培養(yǎng)基內(nèi)加入ADM刺激，研究ADM對DPSCs增殖、凋亡的調(diào)控作用以及其作用

3、機(jī)制。（四）研究ADM對DPSCs的成牙本質(zhì)分化的調(diào)控作用及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.齲壞程度和ADM表達(dá)水平的相關(guān)性研究
　　收集我院臨床拔除的智齒195例，包括齲病95例（根據(jù)齲病分類分為淺齲44例、中齲32例、深齲19例）和健康離體牙100例，拔除后立即取出牙髓組織，ELISA檢測ADM在牙髓液中的表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)檢測ADM在牙髓組織中的表達(dá)及細(xì)胞定位，利用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2.DP

4、SCs的培養(yǎng)和鑒定
　　利用臨床拔除的健康離體牙的牙髓組織剪碎進(jìn)行培養(yǎng)，采用酶消化及過濾的方法得到單細(xì)胞懸液，有限稀釋法原代培養(yǎng)。擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞至第3代，細(xì)胞免疫熒光檢測STRO-1/CD146等DPSCs標(biāo)志物的表達(dá)。體外誘導(dǎo)分化后檢測ALP活性，礦化結(jié)節(jié)形成情況，以及DSP表達(dá)，明確DPSCs是否具有成牙本質(zhì)分化的潛能。
　　3.ADM對DPSCs增殖、凋亡的調(diào)控作用及機(jī)制研究
　　原代DPSCs培養(yǎng)至第3代，加入不

5、同濃度ADM干預(yù)后，通過流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況，通過Western blot檢測凋亡蛋白的表達(dá)，觀察ADM對于DPSCs增殖能力的影響。通過Western blot檢測調(diào)控細(xì)胞增殖關(guān)鍵信號通路蛋白JNK/c-Jun的表達(dá)和磷酸化水平，以及調(diào)控細(xì)胞凋亡關(guān)鍵信號通路蛋白Src/GSK-3β的表達(dá)和磷酸化水平。此外通過ADM及JNK/c-Jun通路抑制劑SP600125共處理，以及ADM與Src/GSK-3β通路抑制劑PP2共處理

6、，探討ADM是否通過激活Src/GSK-3β通路及Src/GSK-3β通路分別調(diào)控DPSCs增殖及凋亡的。
　　4.ADM對DPSCs成牙本質(zhì)分化的作用及機(jī)制研究原代DPSCs培養(yǎng)至第3代，加入ADM(10-8 mol/L)處理24小時，通過Westernblot檢測成牙本質(zhì)分化相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)，同時檢測CREB及磷酸化CREB、BMP2表達(dá)水平。通過熒光素酶活性報(bào)告實(shí)驗(yàn)以及ChIP檢測CREB對于BMP2的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。此外，

7、在ADM處理細(xì)胞同時加入H89抑制CREB磷酸化，或在ADM處理細(xì)胞同時加入Noggin抑制BMP通路，觀察ADM是否通過激活CREB/BMP通路進(jìn)而促進(jìn)DPSCs成牙本質(zhì)分化。
　　結(jié)果：
　　1.齲病和ADM表達(dá)水平的相關(guān)性研究
　　ELISA檢測結(jié)果顯示:齲壞組的牙髓組織液中ADM水平顯著高于健康組，此外發(fā)現(xiàn)，在深齲組、中齲組、淺齲組的牙髓組織液中深齲組ADM水平顯著高于中齲組和淺齲組，中齲病人ADM水平顯著高于

8、淺齲組。通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)ADM在齲壞相鄰的牙髓范圍內(nèi)染色顯示高表達(dá)，并且在修復(fù)性牙本質(zhì)周圍更為顯著。
　　2.DPSCs的培養(yǎng)和鑒定
　　7天后少數(shù)細(xì)胞增殖能力旺盛形成克隆，細(xì)胞呈STRO-1及CD146陽性。礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞可形成礦化結(jié)節(jié)，ALP活性顯著升高，Westernblot檢測顯示細(xì)胞表達(dá)DSP蛋白。
　　3.ADM對DPSCs增殖、凋亡的調(diào)控作用及機(jī)制研究
　　10-7M-10-10M A

9、DM處理細(xì)胞后24hr，ADM處理組G2/S/M期細(xì)胞比例顯著上升而細(xì)胞倍增時間顯著低于空白對照組，其中10-7M及10-8M ADM處理組無顯著差異，但促進(jìn)DPSCs增殖的作用顯著高于其他2組。10-8M ADM處理后，DPSCs中JNK/c-Jun蛋白磷酸化水平明顯增加，10-8M ADM聯(lián)合10μMSP600125處理后，JNK/c-Jun磷酸化水平降低，細(xì)胞增殖能力顯著下降。
　　10-7M-10-10M ADM處理細(xì)胞后

10、24hr，ADM處理組細(xì)胞凋亡率及Caspase3表達(dá)水平顯著下降，其中10-7M及10-8M ADM處理組之間無顯著差異，但抑制DPSCs凋亡的作用顯著高于其他2組。10-8M ADM處理后，DPSCs中Src/GSK-3β蛋白磷酸化水平顯著增加，10-8M ADM聯(lián)合20μM PP2處理DPSCs，Src/GSK-3β磷酸化水平降低，細(xì)胞凋亡率顯著上升。
　　4.ADM對DPSCs成牙本質(zhì)分化的作用及機(jī)制研究
　　10-

11、7 M ADM處理DPSCs后，Alizarin red S染色水平顯著高于對照組。Western blot檢測結(jié)果顯示，ADM處理組RUNX2/ALP/OCN蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組。此外，ADM處理組pCREB表達(dá)水平較對照組顯著上升，但細(xì)胞總CREB水平未見顯著變化。定量PCR和Western blot結(jié)果顯示ADM處理組BMP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對照組顯著上升。熒光素酶活性報(bào)告及ChIP結(jié)果顯示CREB可通過結(jié)合B

12、MP2啟動子-1094至-669區(qū)域促進(jìn)BMP2的轉(zhuǎn)錄。10-7 MADM/5μM H89共處理后pCREB/BMP2/RUNX2/ALP/OCN表達(dá)水平均顯著低于單獨(dú)ADM處理，而10-7 MADM/100ng mL Noggin共處理后RUNX2/ALP/OCN表達(dá)水平均顯著低于單獨(dú)ADM處理。
　　結(jié)論：
　　1.ADM在齲病牙髓組織高表達(dá)，并且與齲病的進(jìn)展呈現(xiàn)正相關(guān)。
　　2.從成體人牙髓組織中可分離培養(yǎng)出DP