腎上腺髓質(zhì)素對骨骼肌缺血再灌注損傷的保護作用研究.pdf

1、目的： 構(gòu)建大鼠腎上腺髓質(zhì)素真核表達質(zhì)粒pVAX1—ADM，注射入大鼠腓腸肌，通過檢測肢體缺血再灌注后，注射部位腓腸肌組織中的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD），血清中的肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）的水平，及組織形態(tài)學檢查來判斷重組質(zhì)粒對骨骼肌缺血再灌注損傷的保護作用。 方法： 1.取雄性SD大鼠腎上腺組織進行總RNA的提取，RT—PCR方法得到ADM基因，克隆到T載體上，進一步亞克隆到pVAX

2、1真核表達載體上，得到重組質(zhì)粒pVAX1—ADM。 2.雄性SD大鼠32只，體重200±10g，按體重隨機分為4組，每組8只，即空載體組（pVAX1）、300μg重組質(zhì)粒組、500μg重組質(zhì)粒組和700μg重組質(zhì)粒組。四組腓腸肌注射含重組質(zhì)粒（pVAX1—ADM）的量分別為0μg、300μg、500μg和700μg，每周1次，共4周。取注射部位腓腸肌組織，RT—PCR和免疫組織學檢查，測定重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平，獲取重

3、組質(zhì)粒最適注射劑量。 3.雄性SD大鼠32只，體重200±10g，按體重隨機分為4組，每組8只，即正常對照組、缺血再灌注（IR）模型組、陽性藥物組（維拉帕米組）、重組質(zhì)粒組。術前，重組質(zhì)粒組腓腸肌注射重組質(zhì)粒700μg，其他三組注射與質(zhì)粒溶液等量的生理鹽水，每周1次，共4周。4周后進行缺血再灌注實驗，缺血3h，再灌注2h。術中，維拉帕米組于再灌注前10分鐘，腹腔注射維拉帕米溶液2mg/kg，其他三組注射等量生理鹽水。術畢，取腓腸

4、肌組織測定MDA的含量、SOD的活力，取血清測定CK、LDH的含量，及腓腸肌組織進行組織學檢查。 結(jié)果： 1.獲得的大鼠腎上腺髓質(zhì)素基因的測序結(jié)果與GeneBank中序列進行比對，完全一致。真核表達質(zhì)粒經(jīng)PCR、XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定顯示，重組質(zhì)粒為陽性。分光光度法對提取的重組質(zhì)粒進行測定，結(jié)果為OD260=0.901，OD280=0.487，OD260/280=1.850，質(zhì)粒濃度為4.5mg/ml。

5、2.定量RT—PCR和免疫組織化學方法對注射重組質(zhì)粒的大鼠腓腸肌組織進行測定，結(jié)果顯示，組織中的表達量隨重組質(zhì)粒注射量的增加而增加。 3.與IR模型組組相比，重組質(zhì)粒組腓腸肌組織中MDA的含量降低32.21％（p<0.01），SOD的含量增加了61.6g％（p<0.05）；血清CK的含量降低了50.69％（p<0.05），LDH的含量降低了28.38％（p<0.05）。 與維拉帕米組相比，重組質(zhì)粒組腓腸肌組織中MDA的含

6、量增加了8.91％（p>0.05），SOD的含量增加了23.71％（p>0.05）；血清中CK的含量增加了20.61％（p>0.05），LDH的含量增加了36.17％，有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。 骨骼肌組織學檢查結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組和維拉帕米組骨骼肌肌纖維少量斷裂和炎性細胞浸潤，骨骼肌水腫，間質(zhì)水腫明顯減輕。 結(jié)論： 1.目的基因ADM成功連接到真核表達載體中，提取的重組質(zhì)粒濃度為4.5mg/ml。 2