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文檔簡介
1、腎上腺髓質(zhì)素對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元的作用及機制目的腎上腺髓質(zhì)素(ADM)是由52個氨基酸組成的血管活性多肽,屬于降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)家族,與多種組織的缺血再灌注損傷有關(guān)。有學(xué)者證實在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有ADM的表達,并與腦缺血再灌注損傷有一定關(guān)系。也有持相反意見的研究報道。所以我們選用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法、原位雜交組織化學(xué)法、逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈式(RT-PCR)分析方法等,驗證正常大鼠腦組織是否有ADM及A
2、DMmRNA的表達及具體表達的部位;觀察ADM及ADMmRNA在局灶性缺血再灌注大鼠腦組織中的表達變化規(guī)律;探討ADM對局灶性缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡、梗死體積及Egr-1mRNA的影響,進一步研究ADM在局灶性缺血再灌注腦損傷中的作用. 方法:健康雄性SD大鼠186只,體重200-250g,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為正常組(n=12),假手術(shù)組(n=12),局灶性腦缺血2h再灌注2h組(n=18)、4h組(n=1
3、8)、22h組(n=54)、46h組(n=18)、70h組(n=18)、118h組(n=18)、166h組(n=18)。其中再灌注22h組又分為:股靜脈注射ADM組(n=12),頸內(nèi)動脈注射ADM組(n=12),側(cè)腦室注射ADM組(n=12)。采用線栓法制成大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型,阻斷血流2h進行再灌注。缺血再灌注各組大鼠在缺血2h再灌注4h時,參考Bederson等的5分制評分標準對其進行神經(jīng)功能缺損評分,評分后分別
4、制備石蠟切片和冰凍切片,TTC染色測定梗死體積,HE染色光鏡下觀察大鼠大腦皮質(zhì)、海馬的組織學(xué)變化,TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡,免疫組織化學(xué)法(SABC法)檢測ADM陽性細胞表達,原位雜交法檢測ADMmRNA及Egr-1mRNA陽性細胞表達,RT-PCR法檢測ADMmRNA在大鼠局灶性腦缺血再灌注前后的表達。原位雜交針對ADM的多相寡核苷酸探針序列為:5′-TGGGTTCACTCGCTTTCCTAGGCGCGGACA-3′;5′-AGAA
5、GTGGAATAAGTGGGCGCTAAGTCGTG-3′;5′-CGTGTCAAACGCTACCGCCAGAGCATCAAC-3′。針對Egr-1的多相寡核苷酸探針序列為:5′-GAGGAGATGATGCTGCTGAGCAACGGGGCT-3′;5′-GCCTTTGCCACTCAGTCGGGCTCCCAGGAC-3′;5′-CCTTTTCTCCCAGGACAATTGAAATTTGCT-3′。RT-PCR針對大鼠ADM前體正義引物為:5
6、′-CCGACAGACAACAGACGC-3′,反義引物為:5′-CACCCTGAGGCAGATGAA-3′,擴增產(chǎn)物278bp;以β-actin為內(nèi)參照,其正義引物為:5′-GATTGCCTCAGGACATTTCTG-3′,反義引物為5′-GATTGCTCAGGACATTTCTG-3′,擴增產(chǎn)物690bp。取擴增產(chǎn)物7μl電泳,經(jīng)溴酚藍染色后用Bio2RADGelDoc2000型影像分析系統(tǒng)檢測并計算出各組ADMmRNA電泳條帶與內(nèi)參
7、照β-actin條帶的表達量像素灰度的比值。 結(jié)果:在正常大鼠大腦內(nèi)有ADM及ADMmRNA的表達,主要表達在大腦皮質(zhì)錐體細胞、海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)、CA4區(qū)錐體細胞、齒狀回顆粒細胞層、丘腦的室旁核、視上核、丘腦內(nèi)側(cè)核、丘腦外側(cè)核、韁內(nèi)側(cè)核、室旁組織、脈絡(luò)叢、室管膜細胞、尾狀核、殼核、蒼白球、血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞,其中室旁組織為高表達區(qū)。缺血再灌注各組大鼠在缺血再灌注后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能損傷,其神經(jīng)功能損傷
8、評分顯著高于假手術(shù)組,p<0.01。大鼠腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)、海馬ADM及ADMmRNA的表達明顯高于正常組大鼠,P<0.01。動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),大腦皮質(zhì)ADM陽性細胞表達在腦缺血2h再灌注22h時達高峰,至再灌注166h仍明顯多于正常對照組,P<0.01。海馬ADM陽性細胞表達在腦缺血2h再灌注4h時達高峰,至再灌注166h仍明顯多于正常對照組,P<0.01。大腦皮質(zhì)ADMmRNA在缺血2h再灌注4h達高峰,再灌注22h已明顯下降,但仍
9、高于正常對照組及假手術(shù)組ADMmRNA的表達,P<0.05,隨缺血再灌注時間延長,ADMmRNA表達又逐漸升高,至再灌注166h其表達仍明顯高于于正常對照組,P<0.05。注射ADM的各組大鼠神經(jīng)功能損傷評分明顯低于缺血再灌注組及假手術(shù)組,P<0.01,尤以頸動脈和側(cè)腦室注射ADM兩組更明顯。大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦梗死體積為269±20mm3,股靜脈注射ADM后,腦梗死體積縮小到239±17mm3,減少11.2%,頸動脈注射ADM后
10、,腦梗死體積縮小到214±14mm3,減少20.4%,側(cè)腦室注射ADM后,腦梗死體積縮小到209±13mm3,減少22.3%。頸動脈注射ADM和側(cè)腦室注射ADM在減少腦梗死體積方面明顯優(yōu)于股靜脈注射ADM,P<0.05,前二者相比并無顯著性差異,P>0.05。缺血再灌注組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)TUNEL染色陽性細胞明顯多于假手術(shù)組,P<0.01。給予ADM后缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)TUNEL染色陽性細胞顯著少于缺血再灌注組
11、,以頸動脈注射ADM組和側(cè)腦室注射ADM組更明顯,P<0.01。假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)有少量Egr-1mRNA陽性細胞表達,缺血再灌注后缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬Egr-1mRNA陽性細胞表達多于假手術(shù)組,P<0.01,應(yīng)用ADM后三組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬Egr-1mRNA陽性細胞的表達明顯高于缺血再灌注組,P<0.01,但以頸動脈注射ADM組和側(cè)腦室注射ADM組Egr-1mRNA陽性細胞表達增高最明顯,P<0.01。 結(jié)論:ADM及AD
12、MmRNA在大腦皮質(zhì)、海馬、齒狀回、丘腦、室旁組織、脈絡(luò)叢、室管膜細胞、基底節(jié)、血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞有表達,ADM在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛分布,預(yù)示著ADM在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有重要的作用。大鼠腦缺血再灌注后2h-166hADM及ADMmRNA在大腦皮質(zhì)、海馬呈現(xiàn)規(guī)律性過表達,且ADMmRNA的表達早于ADM蛋白的表達,可能是神經(jīng)元對缺血再灌注的保護性反應(yīng)機制之一。 股靜脈、側(cè)腦室和頸動脈給予外源性ADM能減少神經(jīng)元凋亡、減少梗死
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