Ammecr基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化及其在文昌魚(yú)和斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá).pdf

1、文昌魚(yú)是現(xiàn)存與脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系最近的無(wú)脊椎動(dòng)物類(lèi)群之一,由于文昌魚(yú)的形體結(jié)構(gòu)及胚胎發(fā)育和脊椎動(dòng)物有許多共同之處,在基因和基因組水平上二者又有很高的同源性,因此文昌魚(yú)是進(jìn)化和發(fā)育生物學(xué)等研究的理想材料。近年來(lái),隨著文昌魚(yú)實(shí)驗(yàn)室連續(xù)繁殖獲得成功和全基因組測(cè)序的完成,極大地推動(dòng)了文昌魚(yú)模式化進(jìn)程,以文昌魚(yú)為對(duì)象的基因功能研究日益增多,文昌魚(yú)的基因及其表達(dá)模式常用于與其他物種,尤其是與脊椎動(dòng)物之問(wèn)的比較基因組學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究。
　　

2、相鄰基岡缺失綜合征(AMME,Alport syndrome.Mental retardaltion,Midfacehypoplasia and Elliptoeytosis.)是由人X染色體上一段序列缺失所致,Ammecr1是位于該缺失序列片段上的基因之一,但該基因的確切功能尚不清楚。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索發(fā)現(xiàn)在脊椎動(dòng)物中存在2個(gè)Ammecr同源基因:Ammecr1和Ammecr11,而在無(wú)脊椎動(dòng)物和細(xì)菌中只有一個(gè)同源基因。為了探索這一基因的功能

3、,本研究克隆了文昌魚(yú)中Ammecr同源基因,進(jìn)而對(duì)Ammecr基因家族的進(jìn)化和文昌魚(yú)Ammecr1基因的表達(dá)進(jìn)行了研究。
　　 文昌魚(yú)的Ammecr1基因(AmphiAmmecr1/11)的cDNA序列全長(zhǎng)2,920bp,其中開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)為738bp,編碼245個(gè)氨基酸。將AmphiAmmecr1/11與脊椎動(dòng)物代表物種人、雞、爪蟾和斑馬魚(yú)以及無(wú)脊椎動(dòng)物海鞘、果蠅和線蟲(chóng)的Ammecr1同源基因進(jìn)行蛋白序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)Ammecr

4、基因家族成員序列相似度很高,尤其是C端區(qū)域:利用蛋白比對(duì)結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示脊椎動(dòng)物.Ammecr1與Ammecr11亞家族分別聚成兩簇,AmphiAmmecr1/11位于這兩基因簇的底部,這個(gè)結(jié)果說(shuō)明脊椎動(dòng)物Ammecr1和Ammecr11可能來(lái)源于同一個(gè)祖先基因,是基因倍增的結(jié)果。然而,在目前所有可用的硬骨魚(yú)數(shù)據(jù)庫(kù)中都只找到一個(gè)Ammecr1基因,設(shè)計(jì)兼并引物用PCR方法也只在斑馬魚(yú)中克隆到Ammecr1基因;由于目前軟骨魚(yú)數(shù)據(jù)

5、庫(kù)不完整,無(wú)法判斷軟骨魚(yú)基因組中Ammecrl同源基因的數(shù)目,本研究又用同樣的PCR方法在軟骨魚(yú)代表——條紋斑竹鯊中成功地克隆到Ammecr1及Ammecr11,這一結(jié)果暗示Ammecr11基因可能在硬骨魚(yú)中發(fā)生丟失,而軟骨魚(yú)和其它脊椎動(dòng)物類(lèi)群中保留了Ammecr1和Ammecr11基因。
　　 為了進(jìn)一步研究脊椎動(dòng)物Ammecr1/Ammecr11的起源問(wèn)題,我們還比較了數(shù)據(jù)庫(kù)中代表物種Ammecr1/Ammecr11同源基因

6、的結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示脊椎動(dòng)物Ammecr1/Ammecr11在外顯子大小和數(shù)目(6個(gè)外顯子)上都相當(dāng)保守,文昌魚(yú)AmphiAmmecr1/11(5個(gè)外顯子)和它們也僅有一個(gè)外顯子之差,且AmphiAmmecr1/11最后一個(gè)外顯子長(zhǎng)度(209bp)恰好與脊椎動(dòng)物中Ammecr1/Ammecr11最后兩個(gè)外顯子長(zhǎng)度之和(212bp)相當(dāng),推測(cè)脊椎動(dòng)物Ammecr1和Ammecr11基因的最后兩個(gè)外顯子是由AmphiAmmecr1/11最后一個(gè)

7、外顯子進(jìn)化而來(lái)。
　　 Ammecr基因分布的廣泛性和序列上的高度相似性暗示了其功能上的保守性。為了研究Ammecrl在脊索動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中是否保留了相同或相似的功能,本實(shí)驗(yàn)利用原位雜交和實(shí)時(shí)熒光定暈PCR方法比較了斑馬魚(yú)Ammecr1和文昌魚(yú)AmphiAmmecr1/11在胚胎的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,斑馬魚(yú)Ammecr1呈現(xiàn)母源表達(dá)特征,在卵母細(xì)胞和受精卵中有大量基因轉(zhuǎn)錄物。同時(shí)發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)Ammecr1也存在合子表達(dá)方式,實(shí)時(shí)熒光

8、定量PCR結(jié)果顯示合子表達(dá)發(fā)生在大約囊胚晚期;24 hpf時(shí)期的胚胎的原位雜交結(jié)果顯示,表達(dá)產(chǎn)物集中在整個(gè)腦部,48 hpf之后,在咽弓和背鰭原基處也檢測(cè)到明顯信號(hào),該結(jié)果說(shuō)明斑馬魚(yú)Ammecr1合子表達(dá)具有時(shí)空特異性,可能參與到腦、咽弓及背鰭的形成與發(fā)育過(guò)程中。
　　 文昌魚(yú)AmphiAmmecr1/11原位雜交和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果同樣顯示出母源表達(dá)特征,但本研究中尚未發(fā)現(xiàn)其合子表達(dá),這可能說(shuō)明Ammecr1是在脊索動(dòng)物進(jìn)