文昌魚nifU-like基因的鑒定、表達和進化分析.pdf

1、文昌魚被認(rèn)為是現(xiàn)存與脊椎動物最接近的原索動物,代表著從無脊椎動物到脊椎動物進化過程中的一個重要的過渡階段,是研究脊椎動物起源與進化的經(jīng)典實驗?zāi)Ｐ?。它的基因序列和表達模式被廣泛的應(yīng)用于比較基因組學(xué)研究以及發(fā)育同源性分析。 nif源于nitrogen fixation,指固氮基因簇,包括nifU、nifH、nifD、nifK和nifV等基因,它們編碼的一系列產(chǎn)物參與固氮反應(yīng)各個環(huán)節(jié)。其中,nifU可以分為三個區(qū)域:N-末端區(qū)域,C

2、-末端區(qū)域和一個中心區(qū)域。只具有N-末端區(qū)域的基因通常稱為砌nifU-Mike基因。 本文從青島文昌魚的腸cDNA文庫中(本實驗室保存)得到一個cDNA克隆L052(Genbank accession number:AY279520),它全長630bp,含有一個495bp的開放閱讀框(ORF),編碼一個164氨基酸殘基組成的多肽,推導(dǎo)的分子量為17.51kDa。該cDNA還包含有一個55bp的5'非編碼區(qū)(UTR),其中包含一

3、個終止密碼子TGA;一個30bp的3'非編碼區(qū)和一個多聚腺苷酸尾巴(polyA)。其編碼的蛋白在5'末端有一起始密碼子ATG,在3'末端有一終止密碼子TAA。所以,L052 cDNA克隆具有完整的編碼區(qū)。 序列比對顯示,L052編碼的蛋白與來自于不同物種的Ni砌-1ike蛋白具有很高的同源性,高達66-86[％];而且它具有高度保守的U-type基序(motif)(C-X<,26>-C.X<,43>-C),這個基序是NifU-

4、like蛋白的典型特征。因此我們初步認(rèn)為L052cDNA克隆編碼NifU-like蛋白。 然而,本實驗室的cDNA文庫是以文昌魚腸RNA為基礎(chǔ)構(gòu)建而成,腸道內(nèi)殘留食物有很多是菌類。為了證明L052 cDNA克隆不是來自于污染微生物,而是來自于文昌魚本身,我們設(shè)計了以下實驗。 首先,以文昌魚精巢和卵巢RNA為模板,根據(jù)L052 cDNA序列設(shè)計引物,進行RT-PCR擴增，產(chǎn)物為一條特異性條帶，并其進行測序。結(jié)果顯示，擴

5、增出的片段與LO52 cDNA上相應(yīng)區(qū)域的序列完全一致。其次，以去除消化道的成體文昌魚總RNA為模板，根據(jù)LO52 cDNA序列合成探針，進行Northel雜交，結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為一條特異性條帶，大小與L052 cDNA序列基本一致。所有這些都說明文昌魚中確實存在nifU-like基因。系統(tǒng)進化分析表明，nifU-1ike蛋白在微生物、無脊椎動物和脊椎動物中各自聚為一個類群。文昌魚NiftJ-like蛋白與無脊椎動物nifU-like

6、蛋白聚為一類，說明其與無脊椎動物nifU-1ike蛋白在進化地位上更加接近。同時，這種聚類情況也說明了L052 cDNA克隆確實來自于文昌魚，而不是來自于污染微生物。 我們還研究了基因在文昌魚中的表達情況。切片原位雜交結(jié)果顯．nifU-like示，青島文昌魚nifu-like基因在消化道(包括咽上溝、內(nèi)柱、肝盲囊和后腸)、腮、卵巢以及精巢中都能檢測到明顯的轉(zhuǎn)錄信號，而在肌肉，脊索以及神經(jīng)管中沒有檢測到信號。這與RT-PCR的分