文昌魚(yú)nifU-like基因的鑒定、表達(dá)和進(jìn)化分析.pdf

1、文昌魚(yú)被認(rèn)為是現(xiàn)存與脊椎動(dòng)物最接近的原索動(dòng)物,代表著從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中的一個(gè)重要的過(guò)渡階段,是研究脊椎動(dòng)物起源與進(jìn)化的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。它的基因序列和表達(dá)模式被廣泛的應(yīng)用于比較基因組學(xué)研究以及發(fā)育同源性分析。 nif源于nitrogen fixation,指固氮基因簇,包括nifU、nifH、nifD、nifK和nifV等基因,它們編碼的一系列產(chǎn)物參與固氮反應(yīng)各個(gè)環(huán)節(jié)。其中,nifU可以分為三個(gè)區(qū)域:N-末端區(qū)域,C

2、-末端區(qū)域和一個(gè)中心區(qū)域。只具有N-末端區(qū)域的基因通常稱(chēng)為砌nifU-Mike基因。 本文從青島文昌魚(yú)的腸cDNA文庫(kù)中(本實(shí)驗(yàn)室保存)得到一個(gè)cDNA克隆L052(Genbank accession number:AY279520),它全長(zhǎng)630bp,含有一個(gè)495bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼一個(gè)164氨基酸殘基組成的多肽,推導(dǎo)的分子量為17.51kDa。該cDNA還包含有一個(gè)55bp的5'非編碼區(qū)(UTR),其中包含一

3、個(gè)終止密碼子TGA;一個(gè)30bp的3'非編碼區(qū)和一個(gè)多聚腺苷酸尾巴(polyA)。其編碼的蛋白在5'末端有一起始密碼子ATG,在3'末端有一終止密碼子TAA。所以,L052 cDNA克隆具有完整的編碼區(qū)。 序列比對(duì)顯示,L052編碼的蛋白與來(lái)自于不同物種的Ni砌-1ike蛋白具有很高的同源性,高達(dá)66-86[％];而且它具有高度保守的U-type基序(motif)(C-X<,26>-C.X<,43>-C),這個(gè)基序是NifU-

4、like蛋白的典型特征。因此我們初步認(rèn)為L(zhǎng)052cDNA克隆編碼NifU-like蛋白。 然而,本實(shí)驗(yàn)室的cDNA文庫(kù)是以文昌魚(yú)腸RNA為基礎(chǔ)構(gòu)建而成,腸道內(nèi)殘留食物有很多是菌類(lèi)。為了證明L052 cDNA克隆不是來(lái)自于污染微生物,而是來(lái)自于文昌魚(yú)本身,我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。 首先,以文昌魚(yú)精巢和卵巢RNA為模板,根據(jù)L052 cDNA序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物為一條特異性條帶，并其進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示，擴(kuò)

5、增出的片段與LO52 cDNA上相應(yīng)區(qū)域的序列完全一致。其次，以去除消化道的成體文昌魚(yú)總RNA為模板，根據(jù)LO52 cDNA序列合成探針，進(jìn)行Northel雜交，結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為一條特異性條帶，大小與L052 cDNA序列基本一致。所有這些都說(shuō)明文昌魚(yú)中確實(shí)存在nifU-like基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，nifU-1ike蛋白在微生物、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中各自聚為一個(gè)類(lèi)群。文昌魚(yú)NiftJ-like蛋白與無(wú)脊椎動(dòng)物nifU-like

6、蛋白聚為一類(lèi)，說(shuō)明其與無(wú)脊椎動(dòng)物nifU-1ike蛋白在進(jìn)化地位上更加接近。同時(shí)，這種聚類(lèi)情況也說(shuō)明了L052 cDNA克隆確實(shí)來(lái)自于文昌魚(yú)，而不是來(lái)自于污染微生物。 我們還研究了基因在文昌魚(yú)中的表達(dá)情況。切片原位雜交結(jié)果顯．nifU-like示，青島文昌魚(yú)nifu-like基因在消化道(包括咽上溝、內(nèi)柱、肝盲囊和后腸)、腮、卵巢以及精巢中都能檢測(cè)到明顯的轉(zhuǎn)錄信號(hào)，而在肌肉，脊索以及神經(jīng)管中沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)。這與RT-PCR的分