轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽與超聲微泡聯(lián)合介導(dǎo)抗腫瘤藥物治療腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生率最高的惡性腫瘤，因血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）的存在以及傳統(tǒng)抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞選擇性不強(qiáng)，導(dǎo)致目前腦膠質(zhì)瘤的臨床療效較差，生存期短。研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡能無創(chuàng)、可逆開放BBB；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Transferrin receptor,TfR）在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜上高表達(dá)；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽（HAIYPRH）能與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜TfR特異性結(jié)合。本課題首次將超聲微泡和結(jié)合肽兩種不同的

2、靶向技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用，超聲微泡介導(dǎo)使藥物透過BBB，在腦部定點(diǎn)釋放；結(jié)合肽介導(dǎo)使藥物對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生選擇性，從而實(shí)現(xiàn)高效率的腦腫瘤靶向治療。鑒于此，本課題以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）和表柔比星（Epirubicin，EPI）為工具藥，評價(jià)HAIYPRH-5-FU和HAIYPRH-EPI兩種復(fù)合物體外抗腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性；同時(shí)評價(jià)HAIYPRH-5-FU復(fù)合物超聲微泡的體內(nèi)靶向性及抗腦膠質(zhì)瘤活性。
　　方法：

3、在第一部分試驗(yàn)中，以EPI為工具藥，谷氨酸為連接物，制備HAIYPRH-EPI復(fù)合物；以5-FU為工具藥，6-氨基己酸為連接物，制備HAIYPRH-5-FU復(fù)合物。在第二部分試驗(yàn)中，主要明確復(fù)合物的抗腫瘤活性及其與TfR表達(dá)的相關(guān)性。首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測U87與LN229腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜表面TfR1表達(dá)差異；然后以U87和LN229膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究對象，采用MTT法考察各組藥物對細(xì)胞增殖抑制作用，計(jì)算存活率評價(jià)細(xì)胞毒性，通過透射電鏡和檢

4、測caspase3,8,9活性觀察細(xì)胞凋亡，利用EPI本身的熒光特性，借助熒光顯微鏡定性和流式細(xì)胞術(shù)半定量觀察EPI和HAIYPRH-EPI細(xì)胞攝取，采用HPLC-MS/MS法定量觀察5-FU和HAIYPRH-5-FU細(xì)胞攝取。在第三部分試驗(yàn)中，我們通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化處方，成功制備載HAIYPRH-5-FU超聲微泡，測定包封率及載藥量，并進(jìn)行形態(tài)觀察、穩(wěn)定性觀察、粒徑、粒度分布與電位檢測。在第四部分試驗(yàn)中，主要考察載HAIYPRH-5-F

5、U超聲微泡的體內(nèi)靶向性及抗腦膠質(zhì)瘤活性，采用立體定向技術(shù)建立大鼠LN229膠質(zhì)瘤模型，通過MRI和HE染色驗(yàn)證模型制作成功，采用HPLC-MS/MS法測定各組織和血液中的5-FU及HAIYPRH-5-FU的濃度，考察其靶向效率，并通過MRI觀察復(fù)合物超聲微泡對腦膠質(zhì)瘤的抑制作用，同時(shí)比較各組大鼠的生存期和體重。
　　結(jié)果：在第一部分試驗(yàn)中，我們成功制備HAIYPRH-EPI和HAIYPRH-5-FU兩種復(fù)合物，質(zhì)譜鑒定分子量與預(yù)期

6、一致，HPLC測定其純度分別為99.03%和99.07%。在第二部分試驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜表面TfR1表達(dá)結(jié)果顯示：U87細(xì)胞膜表面TfR1呈低表達(dá)，而LN229細(xì)胞膜表面TfR1呈高表達(dá)；細(xì)胞毒性與細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：HAIYPRH-EPI與HAIYPRH-5-FU對TfR呈低表達(dá)的U87細(xì)胞的細(xì)胞毒性和促凋亡活性較弱，而在TfR高表達(dá)的LN229細(xì)胞中則呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性和促凋亡活性，且細(xì)胞毒性呈劑量依賴性，外源性加入2

7、5μM Tf能明顯加強(qiáng)復(fù)合物對LN229細(xì)胞的細(xì)胞毒性和促凋亡活性，而EPI和5-FU在U87和LN229細(xì)胞中的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡活性無明顯差別，Tf的加入對該類效應(yīng)也無明顯影響；細(xì)胞攝取結(jié)果與細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡結(jié)果相吻合，顯示：主要依賴被動轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的EPI或5-FU在U87和LN229細(xì)胞中的攝取無明顯差別，但HAIYPRH-EPI或HAIYPRH-5-FU在兩種細(xì)胞中的攝取存在顯著差異，兩種復(fù)合物在LN229細(xì)胞中的攝取明顯高于

8、U87細(xì)胞，且外源性加入25μM Tf能夠顯著加強(qiáng)LN229細(xì)胞對兩種復(fù)合物的攝取。在第三部分實(shí)驗(yàn)中，以HAIYPRH-5-FU為試驗(yàn)藥物，對制備影響較顯著的4個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以包封率為指標(biāo)進(jìn)行評分，優(yōu)選出最佳制備處方，即聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）800mg，司盤801.5ml，初乳水相體積1ml，聚乙烯醇(PVA)體積45ml，并以最佳處方成功制備載HAIYPRH-5-FU超聲微泡。采用HPLC-MS/MS法測得其包封率與

9、載藥量分別為(45.87±0.71)%和（0.86±0.19）%；在形態(tài)及穩(wěn)定性觀察項(xiàng)中，凍干粉重懸于去離子水中，顯微鏡下微泡分布均勻，無粘連，7d時(shí)兩種微泡仍分布均勻，分散度較好；Malvern Zatasizer Nano ZS激光粒度分析儀檢測其平均粒徑與Zeta電位分別為(476.3±143.2)nm和-(12.8±5.86)mV。在第四部分試驗(yàn)中，MRI檢查和HE染色證實(shí)大鼠腦膠質(zhì)瘤模型建立成功。荷瘤大鼠給藥并進(jìn)行超聲輻照，于

10、1h、2h、4h后測定組織分布和靶向效率，結(jié)果顯示，5-FU超聲微泡組與HAIYPRH-5-FU超聲微泡組均呈現(xiàn)明顯的腦部靶向性；藥物處理前后通過MRI觀察腫瘤體積，結(jié)果提示，與5-FU組相比，同劑量的5-FU超聲微泡組第21d腫瘤體積明顯減小，與HAIYPRH-5-FU(0.5mM/kg)組相比，低(0.1mM/kg)、中(0.5mM/kg)、高(1mM/kg)濃度的HAIYPRH-5-FU超聲微泡組在第14d和第21d腫瘤體積均明顯

11、減少，并呈劑量依賴性；各試驗(yàn)組從建模第10天起開始記錄體重，與空白微泡組、5-FU(0.5mM/kg)組和 HAIYPRH-5-FU(0.5mM/kg)組相比，中(0.5mM/kg)、高濃度(1mM/kg) HAIYPRH-5-FU超聲微泡組大鼠體重從第28天開始出現(xiàn)顯著性差異，且HAIYPRH-5-FU超聲微泡組濃度越大體重變化越小，呈現(xiàn)劑量依賴性；在生存曲線中，空白對照組、空白微泡組、5-FU(0.5mM/kg)組、HAIYPRH-

12、5-FU(0.5mM/kg)組、5-FU超聲微泡(0.5mM/kg)組、低濃度HAIYPRH-5-FU超聲微泡(0.1mM/kg)組、中濃度 HAIYPRH-5-FU超聲微泡(0.5mM/kg)組、高濃度HAIYPRH-5-FU超聲微泡(1mM/kg)組的中位生存期分別為26天、24天、34天、25天、45天、49天、52天和63天。
　　結(jié)論：HAIYPRH-抗腫瘤藥物復(fù)合物對TfR呈高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的選擇性和抗腫