冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質瘤的實驗研究及臨床應用研究.pdf

1、概述：
　　 冷凍治療腫瘤已有數(shù)十年歷史。近年來，隨著冷凍設備的更新和冷凍技術的完善，在準確定位腫瘤和最大限度殺滅腫瘤組織等方面取得了長足的進步。
　　 冷凍的作用主要就是使局部快速降溫、凍結、復溫，在此過程中產生一系列的病理變化，最終導致細胞受損而死亡。由細胞內、外液中因凍結而分離出的純水形成冰晶，并由此而產生的一系列變化是冷凍致組織損傷的重要機制。冷凍治療過程中還存在冷凍速度的區(qū)別，因此致細胞損傷的作用機制可能也存在

2、一些差別。目前關于冷凍致細胞死亡的機制主要存在以下幾種學說:①迅速的低溫使細胞內外的水分形成冰晶，細胞脫水，細胞內電解質濃度增高，使脂蛋白復合體受到破壞，引起細胞膜的溶解損傷從而致細胞死亡;②冷凍還可傷害線粒體中的光磷酸化作用，使三磷酸腺苷的合成發(fā)生不可逆性的裂解，造成細胞器膜的損害，而琥珀酸脫氫酶的活性有賴于線粒體膜的完整性，溶酶體膜的破壞可導致其中酶的釋放，引起細胞的自溶，內質網(wǎng)、細胞核的膜均可在冷凍過程中發(fā)生破裂，而細胞可因細胞器

3、的破壞而發(fā)生死亡;③冷凍過程中由于細胞內外冰晶形成，可造成細胞內的脫水狀態(tài)，體液濃縮，細胞內電解質濃縮，濃度達到有害的程度，同時酸堿度也隨之改變，出現(xiàn)細胞酸中毒和代謝障礙，從而導致胞漿、胞膜、細胞內成分蛋白產生變性，進而導致細胞死亡;④冷凍還可使細胞膜、蛋白等細胞成分中的結構水丟失，細胞因此失去功能而死亡;⑤溫度休克學說認為溫度的急劇變化較絕對溫度對細胞的殺傷作用更重要，這可能是由于細胞內組成成分縮脹比率不均衡以致細胞破裂的結果;⑥組織

4、冷凍后，血流速度減慢，這在小靜脈表現(xiàn)的尤為明顯，小靜脈出現(xiàn)血流郁滯，這種血流郁滯乃至造成微循環(huán)的阻斷，另外，冷凍還可直接損傷毛細血管壁，使血小板和其他血細胞與損傷的血管壁黏附，在血管內形成血栓栓塞。毛細血管腔出現(xiàn)阻塞后，則血流停止，組織細胞出現(xiàn)缺血性梗死。
　　 冷凍后繼發(fā)的組織細胞壞死還與冷凍后所引起的一系列生化反應有關。冷凍致細胞死亡的機制可能與細胞凋亡有關。凋亡是與壞死不同的另一種細胞死亡機制，即程序性死亡，它是一種耗能的

5、主動的促細胞消亡的方式。我們前期研究已證實冷凍治療可引起腫瘤中心區(qū)壞死、周邊腫瘤細胞凋亡。而冷凍免疫是冷凍治療的又一重要機制。全身冷凍免疫實驗表明，冷凍HCA實體瘤，除原瘤生長受抑制外，還可能產生腫瘤特異性移植免疫以及抑制再植瘤生長。Bayjoo實驗顯示NK細胞的細胞毒性在冷凍后增強，臨床也偶見原發(fā)灶經(jīng)冷凍后轉移灶自行退縮現(xiàn)象。Joosten等在冷凍治療小鼠皮膚腫瘤（colon26-B）實驗中發(fā)現(xiàn)除局部腫瘤壞死外，還可誘導全身抗腫瘤反應

6、，血漿中IL-1和TNF-α水平較直接切除組高。由此可見冷凍本身能改變機體免疫狀態(tài)，為聯(lián)合TNF-α治療提供了條件。
　　 TNF-α的眾多生物學作用中，其抗瘤作用倍受人們關注。大量實驗研究和初步臨床應用的資料證實TNF-α對某些腫瘤細胞具有細胞抑制和殺傷作用。TNF的抗癌作用主要是由于:①TNF為激發(fā)性細胞因子，可啟動廣泛的免疫炎性反應，介導天然細胞毒細胞、單核細胞和巨噬細胞.對癌細胞的殺傷和溶瘤作用;②TNF可作用于血管內皮

7、細胞，使腫瘤的血管變形受損或形成血栓，導致腫瘤發(fā)生出血性壞死或因營養(yǎng)缺乏而消退;③TNF可通過誘導某些腫瘤細胞凋亡來抑制癌細胞增生。由于其毒副作用和劑量依賴性，TNF-α常與放療，化療（VP16，5-Fu，MMC，ADM等），熱療等聯(lián)合用藥，以提高其抗瘤作用，減少其用量和副作用。
　　 腦膠質瘤約占腦腫瘤總數(shù)的40％～50％，平均生存期僅為51周，多采用手術切除、放療、化療等治療手段，但復發(fā)率高，預后仍不理想。若將冷凍與免疫治療

8、聯(lián)合應用于腦膠質瘤的治療，其療效如何，國內外鮮見報道。本實驗采用冷凍聯(lián)合免疫增強劑——TNF-α治療腦膠質瘤，探討其殺瘤機制，評價其療效，為臨床應用提供理論依據(jù)。
　　 本課題分三個部分:
　　 第一部分:建立大鼠皮層C6腦膠質瘤模型，為腦膠質瘤的研究提供實驗基礎。借助于腦立體定位技術，在雄性Wistar大鼠腦S1區(qū)接種C6細胞懸液。隨機分成4個周組和1個自然死亡組后觀察大鼠的生存期，并采用MRI、病理解剖、HE染色及G

9、FAP免疫組織化學方法，動態(tài)觀察各周組腫瘤生長情況。以了解模型的穩(wěn)定性。
　　 第二部分:冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療C6大鼠腦膠質瘤。本部分通過TUNEL法、流式細胞儀、免疫組化、MRI等手段觀察大鼠C6腦膠質瘤經(jīng)冷凍、rhTNF-α及冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療后，腦膠質瘤細胞凋亡的數(shù)目、p21WAF1/CIP1和PCNA的表達、腫瘤體積、荷瘤鼠生存期、及凋亡、p21WAF1/CIP1、PCNA三者之間的相互關系，以探討它們殺傷

10、腫瘤細胞的作用和機制，為冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質瘤的臨床應用提供理論依據(jù)。
　　 第三部分冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質瘤的臨床研究，對通過MRI初步判斷為腦膠質瘤患者采用冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療。觀察rhTNF-α毒副作用，出院前及以后每6個月復查一次MRI。了解聯(lián)合治療可否降低復發(fā)率，延長病人的生存時間，能否推廣應用。
　　 第一部分:大鼠皮層C6腦膠質瘤模型的建立
　　 目的:為腦膠質瘤

11、的研究提供實驗基礎，建立穩(wěn)定可靠的動物模型。方法:借助于腦立體定位技術，在25只雄性Wistar大鼠腦S1區(qū)接種含有10g/L瓊脂糖的C6細胞懸液。隨機分成4個周組和1個自然死亡組后觀察大鼠的生存期，并采用MRI、病理解剖、HE染色及GFAP免疫組織化學方法，動態(tài)觀察各周組腫瘤生長情況。結果:在不同周組中，所有檢查均顯示C6腦膠質瘤模型的建立成功，GFAP陽性。4周內無死亡，自然死亡組在第5周死亡2只、余3只于第6周死亡。結論:該方法建

12、立的S1區(qū)腦膠質瘤模型具備與人腦膠質瘤生長相似的特性，腫瘤形成時間短，生存期穩(wěn)定，且無腦外轉移和顱外擴散，適合各種腦膠質瘤實驗治療研究。
　　 第二部分:冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療C6大鼠腦膠質瘤的實驗研究
　　 目的：本實驗通過觀察大鼠C6腦膠質瘤經(jīng)冷凍、免疫(rhTNF-α)及冷凍聯(lián)合免疫(rhTNF-α)治療后，腦膠質瘤細胞凋亡的數(shù)目、p21WAF1/CIP1和PCNA的表達、腫瘤體積、荷瘤鼠生存期、及凋亡、p21

13、WAF1/CIP1、PCNA三者之間的相互關系，以探討它們殺傷腫瘤細胞的作用和機制，為冷凍聯(lián)合免疫(rhTNF-α)療法的臨床應用提供理論依據(jù)。
　　 方法：本研究包括(1)C6腦膠質瘤細胞的培養(yǎng)，C6細胞在含有10％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5％-氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)。(2)大鼠C6腦膠質瘤動物模型的建立，選純種Wistar雄性大鼠120只，借助于立體定位技術、將10μl含有1×106個C6細胞懸液緩慢注射入大鼠右側

14、大腦S1區(qū)皮層。(3)動物分組及治療的實施:待腫瘤生長至第14天、直徑約6mm時，隨機將荷瘤鼠分為對照、單冷、單免(rhTNF-α)及凍免(rhTNF-α)四組，每組30只，對不同的組別進行相應的治療。于接種后第21天，每組隨機抽取20只按不同檢測要求取材，各組余10只用于測量腫瘤體積和觀察生存期。(4)TUNEL法和流式細胞儀檢測細胞凋亡。(5)免疫組化方法觀察p21WAF1/CIP1及PCNA蛋白的表達。(6)MRI測腫瘤體積。(7

15、)直接觀察各組荷瘤鼠的生存期。
　　 結果：HE染色顯示顱內腫瘤形成;GFAP陽性。聯(lián)合治療（凍免組）與其他三組比較:腫瘤細胞凋亡、p21WAF1/CIP1蛋白表達顯著增多，PCNA蛋白表達顯著減少，腫瘤體積縮小，生存期延長。凋亡細胞數(shù)與p21WAF1/CIP1蛋白表達呈正相關;與PCNA蛋白表達之間呈顯著負相關;p21WAF1/CIP1蛋白表達也與PCNA蛋白表達之間呈顯著負相關。
　　 結論:凋亡是冷凍、免疫(rhT

16、NF-α)殺傷腫瘤細胞的一個重要機制;冷凍聯(lián)合免疫(rhTNF-α)治療可產生協(xié)同效應;p21WAF1/CIP1參與了凋亡的調控;PCNA參與DNA的合成，其下調反應細胞增殖受抑制，有利于凋亡的發(fā)生，其表達受p21WAF1/CIP1負調控。
　　 第三部分冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質瘤的臨床觀察
　　 目的:探討冷凍切除聯(lián)合重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-α)治療腦膠質瘤的效果。
　　 方法:對于18例腦

17、膠質瘤患者采用冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療。觀察rhTNF-α毒副作用，出院前及以后每6個月復查一次MRI評估治療。
　　 結果:腫瘤全切除17例，1例次全切除。術前9例有病例對側肢力減退者，均在1周內恢復。rhTNF-α常見的毒副作用為發(fā)熱，局部紅腫及肌肉疼痛發(fā)生率為38.9％(7/18)。術后隨訪6～20個月，除1例次全切者術后15個月死亡外，余17例均幸存。
　　 結論:本結果提示冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療腦