抗腫瘤血管新生基因治療腦膠質(zhì)瘤的臨床基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：研究人腦膠質(zhì)瘤Endostatin(ES)基因的定位、分布及腫瘤惡性程度的相關(guān)性；探討以重組Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)為載體，Endostatin基因(HSV-1-EScDNA)對(duì)SD大鼠膠質(zhì)瘤的治療效果及腫瘤微血管密度的變化。 方法：①免疫細(xì)胞化學(xué)分析，檢測(cè)30例不同級(jí)別(WHOⅡ～Ⅳ級(jí))人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中Endostatin的定位及分布；②使用圖文分析系統(tǒng)，對(duì)不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的不同染色強(qiáng)度進(jìn)行灰度值測(cè)定；③對(duì)質(zhì)粒包

2、埋的Endostatin基因(pSecTagA-EScDNA)進(jìn)行測(cè)序鑒定；④采用脂質(zhì)體法將Endostatin基因(pSecTagA-EScDNA)轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EVC-304)，并以RT-PCR、WesternBlot分別從RNA水平和蛋白水平鑒定轉(zhuǎn)染是否成功；⑤以FCM測(cè)細(xì)胞周期，MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)細(xì)胞活力，驗(yàn)證Endostatin基因?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用。⑥以C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞植于SD大鼠腋部皮下制作膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型；⑦以重

3、組Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)為載體，構(gòu)建HSV-1-EScDNA，使用特制的微量注射器，進(jìn)行瘤內(nèi)注射，注射所用的總的病毒滴度為：1×105PFU(克隆形成單位)。⑧分別觀察記錄腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線；并觀察毒性反應(yīng)。⑨對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行微血管標(biāo)記、計(jì)數(shù)，并比較治療前后腫瘤微血管數(shù)量的變化。結(jié)果①在原發(fā)性人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞中均可發(fā)現(xiàn)Endostatin陽性免疫反應(yīng)；高度惡性人腦膠質(zhì)瘤(WHOⅣ級(jí))

4、中Endostatin抗體陽性標(biāo)記細(xì)胞比例明顯低于低度惡性膠質(zhì)瘤(WHOⅡ級(jí))(p=0.009)；②免疫染色后膠質(zhì)瘤細(xì)胞平均灰度值測(cè)定：WHOⅡ級(jí)膠質(zhì)瘤為26.83、WHOⅢ級(jí)為69.63、WHOⅣ級(jí)為86.19，三組之間有顯著差異(p＜0.01)。③測(cè)序結(jié)果，基因序列與GengBank中pSecTagA-ES序列和pSecTagA序列進(jìn)行比對(duì)，完全相同。④Endostatin轉(zhuǎn)染EVC-304細(xì)胞，PCR、Western分別檢測(cè)到ES

5、cDNA；⑤Endostatin轉(zhuǎn)染EVC-304細(xì)胞后，F(xiàn)CM顯示內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，MTT顯示細(xì)胞活力下降；⑥SD大鼠膠質(zhì)瘤經(jīng)Endostatin基因(HSV-1-EScDNA)治療后，腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑、體積明顯縮小、退縮至休眠狀態(tài)，甚至完全消失(1例)。⑦HSV-1-EScDNA治療后殘存腫瘤微血管密度明顯低于對(duì)照組(p＜0.01)。未見明顯毒性反應(yīng)。結(jié)論Endostatin存在于人腦膠質(zhì)瘤多種類型細(xì)胞中，高度惡性膠質(zhì)瘤中Endos