抗腫瘤血管新生基因治療腦膠質(zhì)瘤的臨床基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：研究人腦膠質(zhì)瘤Endostatin(ES)基因的定位、分布及腫瘤惡性程度的相關(guān)性；探討以重組Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)為載體，Endostatin基因(HSV-1-EScDNA)對SD大鼠膠質(zhì)瘤的治療效果及腫瘤微血管密度的變化。 方法：①免疫細胞化學(xué)分析，檢測30例不同級別(WHOⅡ～Ⅳ級)人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中Endostatin的定位及分布；②使用圖文分析系統(tǒng)，對不同級別腦膠質(zhì)瘤細胞的不同染色強度進行灰度值測定；③對質(zhì)粒包

2、埋的Endostatin基因(pSecTagA-EScDNA)進行測序鑒定；④采用脂質(zhì)體法將Endostatin基因(pSecTagA-EScDNA)轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞(EVC-304)，并以RT-PCR、WesternBlot分別從RNA水平和蛋白水平鑒定轉(zhuǎn)染是否成功；⑤以FCM測細胞周期，MTT實驗測細胞活力，驗證Endostatin基因?qū)ρ軆?nèi)皮細胞增殖的抑制作用。⑥以C6膠質(zhì)瘤細胞植于SD大鼠腋部皮下制作膠質(zhì)瘤動物模型；⑦以重

3、組Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)為載體，構(gòu)建HSV-1-EScDNA，使用特制的微量注射器，進行瘤內(nèi)注射，注射所用的總的病毒滴度為：1×105PFU(克隆形成單位)。⑧分別觀察記錄腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線；并觀察毒性反應(yīng)。⑨對腫瘤標(biāo)本進行微血管標(biāo)記、計數(shù)，并比較治療前后腫瘤微血管數(shù)量的變化。結(jié)果①在原發(fā)性人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞及淋巴細胞中均可發(fā)現(xiàn)Endostatin陽性免疫反應(yīng)；高度惡性人腦膠質(zhì)瘤(WHOⅣ級)

4、中Endostatin抗體陽性標(biāo)記細胞比例明顯低于低度惡性膠質(zhì)瘤(WHOⅡ級)(p=0.009)；②免疫染色后膠質(zhì)瘤細胞平均灰度值測定：WHOⅡ級膠質(zhì)瘤為26.83、WHOⅢ級為69.63、WHOⅣ級為86.19，三組之間有顯著差異(p＜0.01)。③測序結(jié)果，基因序列與GengBank中pSecTagA-ES序列和pSecTagA序列進行比對，完全相同。④Endostatin轉(zhuǎn)染EVC-304細胞，PCR、Western分別檢測到ES

5、cDNA；⑤Endostatin轉(zhuǎn)染EVC-304細胞后，F(xiàn)CM顯示內(nèi)皮細胞出現(xiàn)凋亡，MTT顯示細胞活力下降；⑥SD大鼠膠質(zhì)瘤經(jīng)Endostatin基因(HSV-1-EScDNA)治療后，腫瘤生長明顯受抑、體積明顯縮小、退縮至休眠狀態(tài)，甚至完全消失(1例)。⑦HSV-1-EScDNA治療后殘存腫瘤微血管密度明顯低于對照組(p＜0.01)。未見明顯毒性反應(yīng)。結(jié)論Endostatin存在于人腦膠質(zhì)瘤多種類型細胞中，高度惡性膠質(zhì)瘤中Endos