粘細(xì)菌分子伴侶-引領(lǐng)蛋白樣通路的功能研究.pdf

1、目的：
　　菌毛是革蘭氏陰性菌常見的毒性因子，其中分子伴侶/引領(lǐng)蛋白(CU)通路組裝的菌毛最為多見。CU通路包括經(jīng)典型、交替型和遠(yuǎn)古型三大家族，其中遠(yuǎn)古型CU通路分布最廣，存在于許多重要的環(huán)境微生物和致病微生物，但目前對(duì)遠(yuǎn)古型CU通路所組裝的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的形態(tài)和功能了解極少，更不清楚遠(yuǎn)古型CU通路合成細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中從黃色粘球菌模式菌株DK1622基因組篩選出來(lái)了一個(gè)在發(fā)育階段特異表達(dá)的外膜蛋白編碼基因Mx3

2、883，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白與遠(yuǎn)古型CU通路的引領(lǐng)蛋白同源。本論文研究Mx3883所在操縱子功能，并對(duì)該CU樣通路的作用機(jī)制進(jìn)行初步分析，為阻斷遠(yuǎn)古型CU合成細(xì)胞表面粘附性致病因子提供線索。
　　方法：
　　利用報(bào)告基因lacZ和Western blot檢測(cè)Mx3883所在操縱子在粘細(xì)菌發(fā)育階段的表達(dá)情況；RT-PCR分析Mx3883及其比鄰基因的組織結(jié)構(gòu)，確定CU樣操縱子組成成員；基因敲除研究CU樣操縱子成員

3、Mx3884的功能；透射電鏡比較Mx3883突變株和野生型菌株孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)；Western blot分析Mx3885蛋白在粘孢子中的定位；利用生物信息分析結(jié)合蛋白質(zhì)定點(diǎn)突變，分析候選分子伴侶Mx3884蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白Mx3885互作的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.報(bào)告基因檢測(cè)顯示，Mx3883在粘細(xì)菌發(fā)育后15h開始表達(dá)，18h表達(dá)最高，24h后逐漸下降。
　　2.RT-PCR及生物信息證實(shí)黃色粘球菌DK1

4、622中Mx3885-3883為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，構(gòu)成粘細(xì)菌CU樣操縱子，其上游基因Mx3886和下游基因Mx3882不屬于該操縱子。
　　3.Western結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)育開始后18h可以檢測(cè)到Mx3885蛋白的表達(dá)，隨著時(shí)間的推移，蛋白含量不斷增加；Mx3885蛋白時(shí)間表達(dá)譜明顯不同于它在黃色粘球菌另一菌株DZ目的同源蛋白protein U。
　　4.成熟孢子中Mx3885蛋白定位在孢子外殼。
　　5.成功構(gòu)建了Mx38

5、84敲除菌株。在Mx3883阻斷菌株、Mx3884的敲除菌株中幾乎檢測(cè)不到Mx3885蛋白的存在。
　　6.透射電鏡顯示Mx3883阻斷菌株孢子外殼不完整。
　　7.經(jīng)典型CU分子伴侶中負(fù)責(zé)結(jié)合結(jié)構(gòu)亞基的某些保守性氨基酸在Mx3884蛋白中出現(xiàn)了變異，但是與經(jīng)典型CU分子伴侶相似，Mx3884蛋白G1 B折疊鏈中的交替性輸水氨基酸對(duì)于與結(jié)構(gòu)蛋白Mx3885的結(jié)合不可缺少。
　　結(jié)論：
　　1.Mx3885-388

6、3為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，它在粘細(xì)菌發(fā)育時(shí)期特異表達(dá)，且Mx3885蛋白在發(fā)育后期存在于孢子外殼。
　　2.Mx3884蛋白能增強(qiáng)Mx3885蛋白的穩(wěn)定性：Mx3885-3883組成的CU樣操縱子參與Mx3885蛋白向細(xì)胞表面的分泌，與孢子分化有關(guān)，這是CU通路的一個(gè)新功能。
　　3.革蘭氏陰性菌CU菌毛與某些孢子外殼蛋白在進(jìn)化上存在相關(guān)性。
　　4.遠(yuǎn)古型CU通路組裝細(xì)胞表面黏附性因子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)可能與經(jīng)典型CU通路類似但不完