大鼠DnaJ樣蛋白rDJL的功能研究.pdf

1、　　精子發(fā)生是一個高度復雜而有序的過程，在此過程中基因的表達具有嚴格的時間性和空間性，正是這種受到嚴格時空調(diào)控的基因表達，使得睪丸干細胞經(jīng)過有絲分裂、減數(shù)分裂最終分化、發(fā)育為成熟的精子。分離、克隆不同發(fā)育階段的差異表達基因，深入研究它們在精子發(fā)生中的作用，對于闡明精子發(fā)生機理和對人類的生殖健康、避孕疫苗的研制以及男性不育的防治均有重要意義?！　樯钊胙芯縭DJL基因的功能，我們對rDJL蛋白的編碼區(qū)C端進行PCR擴增，并克隆到原核細胞

2、表達載體pGEX-4T-3中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得了高效表達。利用大板膠切膠的方法純化GST-rDJL融合蛋白，以此為抗原，免疫新西蘭大白兔，制備了高效價的抗rDJL蛋白多克隆抗體。用此抗體進行Westernblot分析，在大鼠睪丸組織抽提液得到特異性較高的目的條帶，與rDJL預計分子量相符，能夠用來進行rDJL蛋白的組織和亞細胞定位研究及進一步的功能研究?！　∮米孕兄苽涞目箁DJL抗體進行rDJL蛋自在睪丸組織的免疫組織化學定位研究。結(jié)

3、果顯示：rDJL從精母細胞時期開始表達，直到圓形精子細胞、長形精子細胞和成熟精子，而在精原細胞、Sertoli細胞和睪丸間質(zhì)組織則無rDJL表達。該結(jié)果與Northernblot發(fā)育表達譜的結(jié)果一致。制備生精細胞涂片做細胞免疫熒光的結(jié)果進一步明確了rDJL在生精細胞中的亞細胞定位：在精母細胞中散在分布于胞漿中；在圓形和長形精子細胞中呈偏一側(cè)的核旁定位；在成熟精子中定位于頂體區(qū)和精子尾部。構(gòu)建真核載體轉(zhuǎn)染模式細胞后，發(fā)現(xiàn)外源表達的rDJL