ICA69與葛根芩連湯在疼痛發(fā)生與治療中的作用機制研究.pdf

1、目的:觀察胰島細胞自身抗原蛋白69(Islet cell antigen protein69，ICA69)表達的改變對實驗動物熱痛、機械痛和炎癥性疼痛行為的影響，以此判斷ICA69在不同疼痛模型中的作用，即ICA69與疼痛類型之間的關系，并探討其相關機制。預實驗結果顯示，ICA69可以顯著炎癥性疼痛動物行為學，所以進一步期望從ICA69缺失與神經(jīng)系統(tǒng)功能和ICA69缺失與炎癥發(fā)生關系兩個角度，探討研究ICA69影響炎癥性疼痛的具體機制，

2、為疼痛的診治提供基礎研究的依據(jù)，為進一步研發(fā)疼痛治療藥物與疼痛治療方法拓展思路。觀察葛根芩連湯對糖尿病疼痛的治療作用，并基于ICA69進一步進行機制研究。
　　方法:(1)統(tǒng)計分析野生型小鼠和ICA69-/-小鼠在甩尾實驗、Von Frey機械刺激實驗、甲醛皮下注射炎癥痛實驗中行為學結果，并進行比較，觀察ICA69缺失后對3種疼痛行為的影響。(2)應用逆轉錄PCR技術檢測神經(jīng)系統(tǒng)中ICA69的表達情況，并通過免疫組織熒光染色(Im

3、munofluorescence staining，IF)得到背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglia，DRG)中ICA69陽性神經(jīng)元的分子特性，并比較與炎癥性相關的重要分子，包括非選擇性陽離子通道瞬時感受器電位通道V1、A1(Transient receptor potential cation channel V1、A1，TRPV1、TRPAl)和降鈣素基因相關肽（Calcitonin gene related pepti

4、de，CGRP）在ICA69缺失后，生理狀況下的表達情況。(3)應用蛋白免疫印跡方法(Western blot，WB)檢測炎癥模型動物中ICA69本身在炎癥局部和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的表達水平。應用免疫熒光染色比較野生型小鼠和ICA69-/-小鼠在病理狀態(tài)下炎癥性疼痛相關分子的表達情況。(4)提取野生型小鼠和ICA69-/-小鼠炎癥局部皮膚釋放物，以此作為刺激物分別對野生型小鼠和ICA69-/-小鼠的原代DRG神經(jīng)元進行鈣離子成像研究，判斷

5、ICA69參與炎癥性疼痛干預的機制。(5)根據(jù)上述實驗結果，探討ICA69在炎癥發(fā)生過程中的作用及機制。制備甲醛炎癥疼痛模型后，觀察野生型小鼠和ICA69-/-小鼠局部腫脹情況，以及局部形態(tài)學變化。應用逆轉錄PCR檢測重要的炎癥細胞（巨噬細胞、肥大細胞）中ICA69是否表達，同時檢測炎癥局部釋放物中腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factorα，TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和

6、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)等細胞因子的表達水平。最后通過甲醛刺激原代巨噬細胞實驗檢測ICA69缺失對核轉錄因子NF-κB激活的影響。(6)通過腹腔單次大劑量注射鏈脲佐菌素(STZ)制備小鼠糖尿病疼痛模型，模型制各后給予葛根芩連湯水煎液灌胃，觀察該方劑對模型小鼠血糖、體重、疼痛行為的影響，并進一步檢測其對小鼠胰腺組織ICA69表達水平和血清炎癥因子水平。
　　結果:(1)ICA69的缺失能夠顯著減少實驗動

7、物在甲醛所導致的炎癥性疼痛中的疼痛行為(P＜0.01)，但對實驗動物的熱痛行為學和機械痛行為學未見顯著影響。(2)ICA69在外周神經(jīng)系統(tǒng)中存在表達，其陽性神經(jīng)元多為小直徑的肽能無髓鞘神經(jīng)元，ICA69的缺失對瞬時電壓門控陽離子通道V1(Transient receptor potential cation channel V1，TRPV1)、瞬時電壓門控陽離子通道A1（Transient receptor potential cati

8、on channel A1，TRPA1）和降鈣素基因相關肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP）等在炎癥性疼痛中扮演重要角色的分子表達無顯著影響。(3)甲醛致痛的模型組小鼠炎癥局部和DRG中ICA69的表達水平與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)，同時ICA69-/-小鼠進行造模處理后，TRPV1、TRPA1和CGRP等分子的表達情況與野生型模型鼠比較亦無顯著性差異(P＞0.05)。(4)鈣離子

9、成像結果顯示:野生型小鼠和ICA69-/-小鼠DRG神經(jīng)元對相同的刺激物的反應無顯著性差異(P＞0.05)，而野生型模型小鼠炎癥皮膚釋放物所引起的神經(jīng)元細胞反應比例顯著高于ICA69-/-模型小鼠(P＜0.05)，提示兩種皮膚釋放物的組成存在顯著差異，ICA69可能參與了炎癥的發(fā)生過程而對神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響不明顯。(5)腫脹度檢測實驗和病理學染色實驗均提示ICA69缺失后造模，實驗動物炎癥局部腫脹程度顯著降低(P＜0.05);逆轉錄PC

10、R結果顯示在巨噬細胞和肥大細胞中均存在ICA69的表達;ELISA檢測野生型模型鼠和ICA69-/-模型小鼠炎癥局部皮膚釋放物中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平，結果顯示前兩者在ICA69-/-模型小鼠炎癥局部皮膚釋放物中顯著低表達(P＜0.05);原代細胞培養(yǎng)巨噬細胞，進行核轉錄因子NF-κB激活檢測實驗，結果顯示ICA69缺失后，在甲醛和脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的刺激下，與野生型小鼠巨噬細胞

11、比較，ICA69-/-原代巨噬細胞核轉錄因子NF-κB的激活程度顯著降低(P＜0.05)。(6)葛根芩連湯能夠顯著逆轉由于STZ造模所引起的動物體重、血糖的改變，同時模型小鼠對熱刺激(P＜0.01)、機械刺激(P＜0.01)、冷刺激(P＜0.05)的痛閾降低也可以被葛根芩連湯逆轉。葛根芩連湯能夠顯著降低造模引起的胰腺組織ICA69表達增高，同時模型小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-1β也通過給予葛根芩連湯被顯著降低。
　　結論: