蛋白激酶C參與調(diào)控青桿花粉管的極性生長.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)可逆磷酸化，即蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化是調(diào)節(jié)酶活性的兩個主要翻譯后反映，是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的生理調(diào)節(jié)反應(yīng)，并廣泛參與細(xì)胞內(nèi)各種生理過程。近年來，在動物細(xì)胞和酵母的研究中表明，蛋白激酶C主要是通過調(diào)節(jié)鈣通道活性、微絲骨架和細(xì)胞壁建成等方面調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)建成，如極性生長，但有關(guān)蛋白激酶C在花粉管極性生長過程中的作用機理卻鮮為報道。本實驗中，利用花粉的離體培養(yǎng)和最佳培養(yǎng)基的篩選及其統(tǒng)計學(xué)分析、透射電鏡觀察、蛋白免疫印跡、免疫熒光標(biāo)

2、記以及顯微紅外光譜分析等技術(shù)，研究了蛋白激酶C抑制劑Bisindolymaleimide(BIM)對裸子植物青桿(Pciea wilsonii Mast．)花粉萌發(fā)、花粉管生長速率、花粉管形態(tài)、花粉管超微結(jié)構(gòu)、微絲骨架以及細(xì)胞壁成分等方面的影響，旨在從細(xì)胞水平上探討蛋白激酶C在花粉管極性生長模式的建立和維持中的作用。主要研究結(jié)果如下： 1．根據(jù)對青桿花粉萌發(fā)率和生長狀況的觀察統(tǒng)計，確定了離體花粉萌發(fā)和生長的優(yōu)化條件，其培養(yǎng)基的蔗

3、糖、硼酸和氯化鈣的最適含量分別為：12％，0.02％和0.03％。 2．應(yīng)用免疫印跡技術(shù)，我們利用單克隆抗PKC抗體在青桿花粉管的蛋白提取物中檢測出了一條55 kDa的蛋白條帶，證明了PKC確實存在于青桿花粉管中，相比之下，PKC抑制劑BIM處理導(dǎo)致花粉管中PKC含量在降低。PKC的活力測定進(jìn)一步證實了免疫印跡結(jié)果。 3．Fluo-3/AM標(biāo)記結(jié)果表明對照花粉管頂端普遍存在一個極陡的Ca<'2+>梯度，而BIM處理后Ca

4、<'2+>梯度受到破壞，說明PKC調(diào)控花粉管生長過程中胞外Ca<'2+>的內(nèi)流，并參與維持花粉管頂端的Ca<'2+>梯度，顯示了在調(diào)節(jié)花粉管生長過程中對Ca<'2+>信號調(diào)節(jié)的重要性。 4．應(yīng)用FTTC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色顯示，我們發(fā)現(xiàn)在對照花粉管中束狀微絲以與長軸平行的方向從花粉粒一直延伸到花粉管亞頂端，而花粉管頂端微絲的分布成不規(guī)則狀。BIM處理導(dǎo)致微絲發(fā)生解聚，且解聚狀態(tài)依賴于生長受抑制的程度，通常抑制生長越嚴(yán)重，微絲解聚程

5、度越高。 5 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在對照組的花粉管中，細(xì)胞器呈極性分布，頂端有明顯的分泌囊泡透明區(qū)；而BIM處理導(dǎo)致花粉管中細(xì)胞器極性分布模式破壞，頂端分泌囊泡的數(shù)量減少，透明區(qū)消失，液泡大量聚集在頂端，并導(dǎo)致高爾基體解體和線粒體膜膨脹。這些結(jié)果充分地說明了抑制劑處理破壞了花粉管的分泌系統(tǒng)。 6．利用單克隆抗體JIM5和JIM7，我們發(fā)現(xiàn)對照花粉管中酯化果膠主要聚集于花粉管頂端，而酸性果膠則主要分布在花粉管兩側(cè)壁。熒光標(biāo)記

6、結(jié)果表明正常青桿花粉管中纖維素和胼胝質(zhì)在整個花粉管壁上均有分布。而BIM處理明顯導(dǎo)致花粉管壁上的酸性果膠、酯化果膠和纖維素含量下降以及胼胝質(zhì)在花粉管頂端的沉積。此外，我們還利用FTIR技術(shù)進(jìn)一步分析了BIM處理對花粉管壁的組分變化，實驗結(jié)果再次表明BIM處理導(dǎo)致花粉管壁果膠組分的含量大量下降，使得花粉管壁的結(jié)構(gòu)隨之變得疏松，破壞了細(xì)胞壁的正常構(gòu)建。 綜上所述，我們可以認(rèn)為，PKC通過(1)調(diào)節(jié)質(zhì)膜Ca<'2+>通道活性參與維持花