泛素-蛋白酶體途徑在青扦花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)過程中的作用.pdf

1、本文利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、超微結(jié)構(gòu)觀察、免疫膠體金標(biāo)記、免疫熒光標(biāo)記、免疫印跡以及顯微紅外光譜分析等技術(shù)，比較系統(tǒng)地研究了蛋白酶體抑制劑MG132以及epoxomicin對(duì)裸子植物青扦(Piceawilsonii)花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)速率、花粉管形態(tài)、花粉管超微結(jié)構(gòu)，細(xì)胞骨架以及細(xì)胞壁成分等方面的影響，旨在從細(xì)胞水平進(jìn)一步探討泛素/蛋白酶體途徑在花粉管極性生長(zhǎng)模式的建立和維持中的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：可逆性的蛋白酶體抑制劑MG132不

2、僅劑量依賴性的遲滯青扦花粉萌發(fā)，而且時(shí)間依賴性地抑制花粉管生長(zhǎng)，并引起花粉管頂端膨大、直徑不規(guī)則變粗以及花粉管細(xì)胞質(zhì)液泡化等現(xiàn)象；此外，不可逆的蛋白酶體抑制劑epoxomicin處理青扦花粉管也得到與MG132處理類似的結(jié)果，而非蛋白酶體抑制劑E-64處理并不對(duì)青扦花粉管產(chǎn)生類似作用；熒光分光光度計(jì)法分析花粉蛋白粗提物降解人工合成的蛋白酶體熒光底物sLLVY-AMC結(jié)果證實(shí)正常青扦花粉管中存在活躍的蛋白酶體活性，而MG132劑量依賴性地

3、抑制蛋白酶體活性；免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)MG132處理導(dǎo)致花粉管中泛素綴合蛋白的大量積累；TEM分析結(jié)果表明，正?；ǚ酃苤屑?xì)胞器呈極性分布，而MG132處理導(dǎo)致花粉管細(xì)胞器極性分布模式破壞，并引起花粉管中ER起源的細(xì)胞質(zhì)液泡化；免疫金標(biāo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明MG132處理后導(dǎo)致花粉管細(xì)胞質(zhì)和ER上積累了大量的泛素綴合蛋白，這一結(jié)果與以往認(rèn)為的UPP參與動(dòng)物細(xì)胞ER中錯(cuò)誤翻譯(或折疊)蛋白的清除一致；利用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，我們發(fā)現(xiàn)正?；?/p>

4、粉管中，微絲以與花粉管長(zhǎng)軸平行的方向，從花粉管基部一直延伸到花粉管亞頂端，而抑制劑處理時(shí)間依賴性地導(dǎo)致花粉管中微絲骨架解聚；熒光標(biāo)記結(jié)果還表明Mg132處理導(dǎo)致花粉管中微管排列紊亂，尤其在花粉管頂端和亞頂端區(qū)域；Fluo-3/AM標(biāo)記結(jié)果表明正常生長(zhǎng)的花粉管頂端存在一個(gè)顯著的鈣離子梯度，而MG132處理后花粉管頂端的鈣離子梯度雖然下降的更快，但梯度仍然存在；利用共聚焦顯微鏡得到的顯微縮時(shí)電影結(jié)果表明，抑制劑處理導(dǎo)致花粉管中胞質(zhì)環(huán)流的速度

5、和方向發(fā)生顯著變化，這從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)抑制劑處理引起細(xì)胞骨架，尤其是微絲骨架的破壞；此外，利用單克隆抗體JIM5和JIM7，我們發(fā)現(xiàn)正?；ǚ酃苤絮セz集中分布于花粉管頂端，而酸性果膠則從花粉管亞頂端朝花粉管基部逐漸增強(qiáng)，而抑制劑處理后導(dǎo)致花粉管細(xì)胞壁中果膠含量急劇下降，果膠的分布模式也發(fā)生顯著變化；利用熒光增白劑，我們發(fā)現(xiàn)抑制劑處理還導(dǎo)致花粉管中纖維素含量的急劇下降，尤其是花粉管頂端和亞頂端區(qū)域；為了進(jìn)一步證實(shí)MG132處理引起的花粉

6、管細(xì)胞壁成分的變化，我們還利用FTIR技術(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果再一次表明蛋白酶體抑制劑處理劑量依賴性地導(dǎo)致花粉管細(xì)胞壁的各種成分含量下降，尤其在花粉管的頂端和亞頂端區(qū)域。上述結(jié)果中，蛋白酶體抑制劑處理引起花粉管中細(xì)胞骨架，尤其是微絲骨架的解聚以及花粉管細(xì)胞壁構(gòu)建紊亂在國(guó)內(nèi)外尚屬首次報(bào)道；而抑制劑處理引起花粉管中ER起源的細(xì)胞質(zhì)液泡化在植物細(xì)胞中也是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)。根據(jù)上述研究結(jié)果，結(jié)合前人報(bào)道，我們認(rèn)為泛素/蛋白酶體途徑通過參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中相關(guān)蛋

7、白的清除(ER-AssociatedproteinDegration；ERAD)以及細(xì)胞質(zhì)中一些與細(xì)胞骨架構(gòu)建緊密相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)，在青扦花粉管極性生長(zhǎng)過程中起重要作用；抑制花粉管中蛋白酶體的正常功能引起花粉管中泛素化蛋白質(zhì)的積累，導(dǎo)致ER起源的細(xì)胞質(zhì)液泡化以及細(xì)胞骨架，尤其是微絲骨架構(gòu)建紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度下降。考慮到植物細(xì)胞延伸取決于細(xì)胞內(nèi)膨壓以及細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞內(nèi)膨壓的耐受程度。抑制劑處理一方面引起花粉管中ER起源的細(xì)胞質(zhì)液泡化