鹽堿地星星草(Puccinellia tenuiflora)根cDNA文庫構(gòu)建與PtLIR1克隆及表達(dá)分析.pdf

1、星星草（Puccinellia tenuiflora）是一種耐鹽堿能力較強(qiáng)的鹽生植物，是分離耐鹽堿基因和研究植物耐鹽堿分子機(jī)制的良好材料。本研究利用SMART技術(shù)構(gòu)建了鹽堿地星星草根的cDNA文庫，隨機(jī)挑取了25個插入片段大于500 bp的克隆進(jìn)行測序和初步的生物信息學(xué)分析；利用RT-PCR技術(shù)克隆了星星草PtLIR1基因的編碼區(qū)cDNA，構(gòu)建了PtLIR1基因的植物表達(dá)載體pPtLIR1-GFP-35S；測定了Na2CO3脅迫下星星草

2、根中可溶性糖和蔗糖含量的變化；采用半定量RT-PCR的技術(shù)分析了Na2CO3脅迫條件下PtLIR1基因與PtSS基因的表達(dá)特性及其與蔗糖積累的相關(guān)性。主要研究結(jié)果如下：
　　1、本研究構(gòu)建了鹽堿地星星草根的cDNA文庫，擴(kuò)增后文庫的滴度為1.747×109 cfu/mL，文庫的重組率為70.83％。隨機(jī)挑取了25個陽性重組子進(jìn)行測序，共得到20條表達(dá)序列標(biāo)簽序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：有4條序列沒有找到相似的序列，8條序列有明確

3、的功能注釋，8條序列均為預(yù)測蛋白或未命名蛋白，篩選到AdoMet synthase基因與泛素蛋白連接酶基因等與植物耐鹽性有關(guān)的基因片段。
　　2、利用RT-PCR技術(shù)從星星草根中擴(kuò)增了PtLIR1基因的編碼區(qū)cDNA片段，將其與pMD19-T Simple Vector連接，將重組DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR篩選與酶切鑒定，得到了PtLIR1基因的陽性重組質(zhì)粒pT-PtLIR1，測序和Bla

4、stN分析結(jié)果顯示，克隆的PtLIR1基因的編碼區(qū)cDNA片段的序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列的相似性達(dá)到99%。
　　3、利用RT-PCR技術(shù)分析了PtLIR1基因在Na2CO3脅迫條件下的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)：
　?。?）在鹽脅迫與非脅迫條件下，PtLIR1基因都在星星草根與葉中均表達(dá)。在鹽鹽堿地條件下，PtLIR1基因在根中的表達(dá)水平高于在葉中的表達(dá)水平。PtLIR1基因可能在星星草根適應(yīng)鹽堿地條件的過程中發(fā)揮重要作用。
　　

5、（2）無論在低濃度（150 mM）還是高濃度（200 mM）Na2CO3脅迫下，PtLIR1基因都呈現(xiàn)出彼此相似且與非脅迫條件下相反的變化趨勢。PtLIR1基因?qū)Φ蜐舛龋?50mM）脅迫呈現(xiàn)出瞬時性高水平的應(yīng)答，對高濃度（200 mM）Na2CO3脅迫呈現(xiàn)出階段性的持續(xù)性應(yīng)答。PtLIR1基因參與星星草根系對Na2CO3脅迫的應(yīng)答，其表達(dá)特性與Na2CO3脅迫濃度密切相關(guān)。
　　4、擴(kuò)增了不含有終止密碼子的PtLIR1基因的編碼區(qū)

6、cDNA，構(gòu)建了PtLIR1基因的植物表達(dá)載體pPtLIR1-GFP-35S，為進(jìn)一步分析其在細(xì)胞中的定位，從而深入分析其功能奠定了基礎(chǔ)。
　　5、利用RT-PCR技術(shù)分析了PtSS基因在Na2CO3脅迫條件下的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)：
　?。?）在非脅迫條件下蔗糖合成酶基因PtSS在星星草根中表達(dá)，表達(dá)水平相對比較穩(wěn)定，PtSS基因在正常生長狀態(tài)下的星星草根中發(fā)揮著重要的作用。
　?。?）在Na2CO3脅迫下PtSS基因的表

7、達(dá)水平受到了明顯的抑制。在低濃度Na2CO3脅迫下PtSS基因表達(dá)水平的變化相對比較平緩，而在高濃度Na2CO3脅迫下PtSS基因表達(dá)水平的變化則比較劇烈。PtSS基因參與星星草根對鹽脅迫的應(yīng)答。
　　6、利用RT-PCR技術(shù)分析了Na2CO3脅迫條件下星星草根中PtSS基因與PtLIR1基因?qū)φ崽欠e累的協(xié)同調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)：
　?。?）鹽脅迫下星星草根中PtLIR1基因的表達(dá)水平受到可溶性糖的調(diào)控，PtLIR1基因表達(dá)水平的變化