草魚(yú)腸道組織消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、魚(yú)類生活在一個(gè)水體環(huán)境，其大面積的黏膜是病原感染魚(yú)類時(shí)最先接觸的部位，它們產(chǎn)生的黏膜免疫反應(yīng)是魚(yú)類參與免疫應(yīng)答過(guò)程的一個(gè)重要組成部分。本研究通過(guò)人工灌注嗜水氣單胞菌，采用抑制性消減雜交(SSH)的方法構(gòu)建了草魚(yú)腸道組織差異表達(dá)消減cDNA文庫(kù)，并對(duì)cDNA文庫(kù)克隆進(jìn)行了部分測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了同源性搜索和功能的分類。同時(shí)，對(duì)參與腸道組織免疫相關(guān)因子組織相容性復(fù)合物(MHC-Ⅱα)、Alpha-1-微球蛋白/bulinin前體蛋白基因的c

2、DNA全長(zhǎng)進(jìn)行克隆、序列分析，探討了它們?cè)诓蒴~(yú)不同組織中的表達(dá)分布。這些階段性研究為進(jìn)一步研究、闡釋魚(yú)類黏膜免疫機(jī)制積累了重要材料。本文的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1．消減cDNA文庫(kù)構(gòu)建及其序列分析 采用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建了草魚(yú)腸道組織在細(xì)菌誘導(dǎo)條件下和未誘導(dǎo)條件下，兩個(gè)不同生理狀態(tài)的消減cDNA文庫(kù)，隨機(jī)挑取211個(gè)cDNA克隆進(jìn)行了單向測(cè)序，共獲得有效cDNA序列147個(gè)。 序列同源性搜索

3、結(jié)果顯示，在147個(gè)有效cDNA序列中，有97個(gè)克隆與GenBank中的已知功能序列具有較高的同源性，其中包含28條MHC類EST序列；17個(gè)與未知功能的序列有一定的同源性；33個(gè)序列在Blast搜索中沒(méi)有找到任何對(duì)應(yīng)的相似序列，可能是沒(méi)有鑒定的EST。97個(gè)已知功能的EST分別屬于46個(gè)不同的基因。 根據(jù)Adams對(duì)功能基因的分類方法，所獲得EST分為8類，蛋白質(zhì)與基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)、代謝、細(xì)胞防御、細(xì)胞分裂和

4、其它未知功能的蛋白，在本實(shí)驗(yàn)獲得的EST分類，細(xì)胞防御類cDNA序列所占比例最高，為序列總數(shù)的27.2％，其次為信號(hào)傳導(dǎo)和代謝，分別為12.9％、12.2％，蛋白質(zhì)與基因表達(dá)為11.6％。細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂兩者所占比例相對(duì)偏低，說(shuō)明在外源刺激的條件下，腸道組織細(xì)胞的防御、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝、蛋白質(zhì)與基因表達(dá)相關(guān)因子都有一定的表達(dá)上調(diào)，特別是與防御相關(guān)因子。 2．草魚(yú)腸道免疫相關(guān)基因MHC-Ⅱα的cDNA的克隆及序列分析

5、 根據(jù)草魚(yú)消減文庫(kù)獲得的EST序列(GenBank Acc No：EW688194)設(shè)計(jì)特異性引物，分別用5’-RACE和3’-RACE的方法獲得MHC-Ⅱα基因的全長(zhǎng)cDNA序列(GenBank Acc No：EU186148)。采用生物信息學(xué)分析了MHC-Ⅱα基因cDNA序列的結(jié)構(gòu)組成特點(diǎn)，結(jié)果表明，所獲得的MHC-Ⅱα基因cDNA全長(zhǎng)為1007bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為717bp；可編碼238個(gè)氨基酸；5’非翻譯區(qū)34bp，3’非翻譯

6、區(qū)256bp；在nt962-967有一個(gè)AATAAA加尾信號(hào)。由MHC-Ⅱα基因cDNA推斷的氨基酸序列編碼蛋白的等電點(diǎn)為4.92，分子量為26.4KDa。在序列的前部分存在一個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，在第210-232位存在一個(gè)跨膜區(qū)。氨基酸序列比較結(jié)果，草魚(yú)MHC-Ⅱα氨基酸序列與鯉魚(yú)：MHC-Ⅱα相似性最高，其次為斑馬魚(yú)，與比較的序列中的護(hù)士鯊相似性最低。系統(tǒng)進(jìn)化聚類分析研究表明，草魚(yú)與鯉魚(yú)、斑馬魚(yú)進(jìn)化親緣關(guān)系最近，與護(hù)士鯊、

7、非洲鯛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。RT-PCR半定量分析組織中的表達(dá)分布，誘導(dǎo)后結(jié)果顯示，MHC-Ⅱα在脾臟、頭腎、后腸有較高的表達(dá)，在肝臟表達(dá)較低，在肌肉中幾乎不表達(dá)。 3．草魚(yú)腸道組織免疫相關(guān)基因Alpha-1-microglobulling precursor,AMBP全長(zhǎng)cDNA克隆與序列分析 根據(jù)草魚(yú)消減cDNA文庫(kù)獲得的EST序列(Genbank Acc No：EW688152)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異性引物，采用5’RACE和3’

8、RACE方法，經(jīng)拼接獲得AMBP基因全長(zhǎng)cDNA序列(Genbank Ace No：EU186151)。AMBP基因cDNA全長(zhǎng)序列為1230bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?047bp，可編碼348個(gè)氨基酸。cDNA序列組成上，在3’端存在2個(gè)不穩(wěn)定的信號(hào)ATTTA和一個(gè)加尾信號(hào)AATAAA。生物信息學(xué)方法對(duì)AMBP基因cDNA分析表明，AMBP編碼的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為6.27，分子量為38.84KDa。在AMBP中存在一個(gè)由18個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，

9、但沒(méi)有預(yù)測(cè)到跨膜區(qū)域。經(jīng)Swiss-Model預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)AMBP的空間結(jié)構(gòu)由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成，一個(gè)屬于lipocalin家族蛋白的α-1-微球蛋白，一個(gè)為胰蛋白酶抑制劑(Bikunin)。 經(jīng)Clustal W同源性序列比較發(fā)現(xiàn)，AMBP氨基酸序列在相近物種中具有較高的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)明顯分為二大支，草魚(yú)的AMBP與斑馬魚(yú)親緣關(guān)系最近，其次是大西洋鮭魚(yú)和虹鱒，在進(jìn)化上它們共聚為一個(gè)大支，人、鼠、牛、豬它們?cè)谶M(jìn)化上相近，聚為一