鄂倫春馬cDNA文庫構(gòu)建及CCL2基因的克隆與表達研究.pdf

1、鄂倫春馬是我國重要瀕危物種之一，現(xiàn)存數(shù)量極少、不足千匹，構(gòu)建鄂倫春馬的cDNA文庫對于鄂倫春馬遺傳資源的保護以及馬基因功能的研究具有重要意義。本研究構(gòu)建了鄂倫春馬耳緣組織cDNA文庫，成功從文庫中克隆了單核細胞趨化蛋白(MCP-1，macrophagechemotacticprotein)基因，即CCL2基因，順利構(gòu)建了CCL2基因的原核和真核表達載體，并在體外培養(yǎng)蒙古馬成纖維細胞中進行了表達和亞細胞定位研究。 本研究取鄂倫春馬

2、耳緣組織，提取總RNA，運用SMARTTM技術(shù)構(gòu)建了鄂倫春馬耳緣組織cDNA文庫。所構(gòu)建的cDNA文庫未擴增文庫滴度為3.09x106pfu/ml，擴增后文庫的滴度為1.4x1010pfu/ml。從擴增文庫中隨機挑取96個克隆進行PCR鑒定，結(jié)果表明重組率為93.75％，插入片段平均大小為1.1kb。本研究的實施不僅對于馬基因結(jié)構(gòu)與功能研究具有重要意義。更重要的是對于鄂倫春馬基因資源的保存具有重要意義。 本研究取蒙古馬的耳緣組織

3、，通過組織塊貼壁培養(yǎng)法，成功構(gòu)建了蒙古馬的成纖維細胞系，并對所建細胞系進行了各項生物學(xué)特性檢測。結(jié)果表明，細胞系的各項指標均達到美國典型培養(yǎng)物中心(AmericantypeCultureCollection，ATCC)細胞系鑒定標準，為研究外源基因在成纖維細胞中的表達與調(diào)控提供了優(yōu)質(zhì)的靶細胞。 本研究成功構(gòu)建了CCL2基因的原核表達載體pGEX-4T-1-CCL2。并設(shè)置IPTG的終濃度梯度進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE檢測pG

4、EX-4T-1-CCL2融合蛋白的表達結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組在36kD左右的位置出現(xiàn)CCL2融合蛋白的表達帶，但各實驗組之間的差異不明顯，表明CCL2基因在BL21菌中表達成功，但誘導(dǎo)條件需要進一步優(yōu)化。 本研究利用構(gòu)建好的鄂倫春馬耳緣組織cDNA文庫為模板，成功克隆了CCL2基因，將CCL2基因完整的編碼區(qū)定向插入真核表達載體pEGFP-N3，pEYFP-N1和pDsRed1-N1的多克隆位點EcoRI和SalI之間，

5、成功構(gòu)建帶有熒光蛋白報告基因的真核重組表達載體pEGFP-N3-CCL2、pEYFP-N1-CCL2和pDsRed1-N1-CCL2。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將pEGFP-N3-CCL2、pEYFP-N1-CCL2和pDsRed1-N1-CCL2導(dǎo)入蒙古馬體外培養(yǎng)成纖維細胞中。對CCL2基因的表達、亞細胞定位、陽性細胞生長與增殖狀況以及細胞活力進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后24、48和72h，各個重組融合蛋白的轉(zhuǎn)染率在11.1％～36.3％之