兩種蕓薹屬葉色突變體葉綠素合成調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、葉色突變體是一類(lèi)由于葉綠素含量發(fā)生明顯變化而呈現(xiàn)出不同葉片顏色的突變,是研究葉綠素代謝和質(zhì)體發(fā)育的良好材料。葉綠素是光合作用中最主要的色素之一,對(duì)植物體非常重要,但是游離葉綠素及其前體會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成光氧化傷害,因此植物體進(jìn)化出一系列復(fù)雜的機(jī)制來(lái)精確調(diào)控葉綠素合成過(guò)程,使其能夠迅速反應(yīng)于不斷變化的生理生化狀態(tài)以及外界環(huán)境。雖然葉綠素的生物合成過(guò)程已經(jīng)研究得比較清楚,高等植物中所有的葉綠素合成關(guān)鍵酶也已經(jīng)被鑒定了出來(lái),但由于整個(gè)葉綠素合成

2、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性,還有很多關(guān)鍵的問(wèn)題研究得不夠深入,也無(wú)從下手。而葉色突變體中必然有葉綠素代謝過(guò)程的某一環(huán)節(jié)發(fā)生了突變,可以為我們研究葉綠素代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供難得的切入點(diǎn)。
　　羽衣甘藍(lán)白鴿和烏塌菜都是十字花科蕓薹屬中的葉色突變體,過(guò)去對(duì)它們突變機(jī)理的研究非常稀少,是兩種很有價(jià)值的研究材料。本文以羽衣甘藍(lán)白鴿和綠鴿,小白菜和烏塌菜為研究材料,對(duì)兩種葉色突變體:羽衣甘藍(lán)白鴿和烏塌菜進(jìn)行了生物化學(xué)和分子生物學(xué)分析,主要研究結(jié)果如下:

3、r>　　(1)白鴿(Brassicaoleraceavar.acephalaf.tricolor)是羽衣甘藍(lán)中的一種溫度敏感的葉色突變體,在低溫條件下其中心部分會(huì)變成純白色。綠鴿是羽衣甘藍(lán)中的另一個(gè)品種,在低溫條件下植株仍是綠色。白鴿中的葉綠素含量在低溫條件下急劇減少,而綠鴿中的葉綠素含量在相同的溫度條件下只是略微減少。檢測(cè)了白鴿和綠鴿中的五種葉綠素前體后發(fā)現(xiàn),在低溫條件下,白鴿中的葉綠素合成被抑制在Pchlide這一步,導(dǎo)致Mg-Pr

4、otoIX發(fā)生積累。定量PCR的結(jié)果顯示低溫條件下白鴿中葉綠素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)從POR開(kāi)始急劇降低,白鴿中的CISC和DBB1B明顯受到低溫的誘導(dǎo)而表達(dá)急劇增加。透射電子顯微鏡的結(jié)果顯示生長(zhǎng)在室溫條件下的白鴿嫩葉中有正常的葉綠體,而生長(zhǎng)在低溫條件下的白鴿嫩葉中只有未分化的前質(zhì)體。以上結(jié)果表明低溫明顯抑制了白鴿嫩葉中的質(zhì)體發(fā)育,并通過(guò)下調(diào)下游的葉綠素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)將白鴿中的葉綠素合成抑制在了Pchlide這一步,導(dǎo)致低溫條件下白鴿嫩

5、葉中的前質(zhì)體未分化為葉綠體,白鴿嫩葉呈現(xiàn)為純白色。一些與葉綠素積累相關(guān)的基因的表達(dá)也受此影響,特別是白鴿中的CISC和DBB1B,在低溫條件下表達(dá)急劇增加。
　　(2)為了更加深入的研究羽衣甘藍(lán)白鴿中的葉綠素合成調(diào)控機(jī)制,我們對(duì)白鴿和綠鴿花瓣、花蕾、花柄和嫩葉中的葉綠素合成情況進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)物種不同組織中的葉綠素含量有著完全一致的趨勢(shì),即:嫩葉中的葉綠素含量最高,花柄次之,花瓣再次,花蕾中的葉綠素含量最低。定量PCR的

6、結(jié)果顯示,綠鴿葉綠素合成結(jié)構(gòu)基因基本都是在嫩葉中的表達(dá)量最高,在花柄中次之,在花瓣和花蕾中的表達(dá)量較低,與其葉綠素含量是基本對(duì)應(yīng)的。白鴿上游的葉綠素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式與綠鴿明顯不同,在嫩葉中的表達(dá)量明顯降低;下游的葉綠素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式則與綠鴿非常相似,都是在嫩葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織。一些與葉綠素積累相關(guān)的基因的表達(dá)情況也同時(shí)進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DBB1A、DBB1B以及GUN4在羽衣甘藍(lán)白鴿不同組織中的的表達(dá)模式與綠鴿非

7、常相似,而DET1和CISC在羽衣甘藍(lán)白鴿不同組織中的表達(dá)模式卻與綠鴿有較大差異。DET1和CISC均與質(zhì)體發(fā)育有密切關(guān)系,很有進(jìn)一步研究的價(jià)值。
　　(3)烏塌菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinesis(L.)Makinovar.rosularisTsenetLee)是蕓薹屬中的一種高葉綠素突變體,表現(xiàn)為墨綠色的葉片。烏塌菜中的葉綠素含量比其同種的小白菜要高65.2％。對(duì)五種葉綠素前體進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn):小

8、白菜和烏塌菜中的CoprogenIII含量沒(méi)有明顯差異,烏塌菜中的ProtoIX和Pchlide含量明顯高于小白菜,而UrogenIII以及Mg-ProtoIX含量則比小白菜中略低。此外,烏塌菜中的血紅素含量比小白菜中高78.13%。定量PCR的結(jié)果顯示,在兩個(gè)物種中HEMG2的表達(dá)沒(méi)有明顯差異。PPOX,ChlI,MTF,DVR,PORB和PORC在烏塌菜中的表達(dá)水平要低于小白菜中,而ChlD,ChlH,MTF,ChlP,CS和CAO

9、則高于小白菜中。烏塌菜葉綠素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)與其葉綠素及葉綠素前體含量并不是一一對(duì)應(yīng)的。烏塌菜中的ChlH以及GUN4的表達(dá)水平分別是小白菜中的約1000倍和5倍。透射電子顯微鏡的結(jié)果顯示烏塌菜葉綠體的類(lèi)囊體膜系統(tǒng)比小白菜葉綠體發(fā)達(dá)得多,片層堆積更多,更密集。GUN4不僅是質(zhì)體-細(xì)胞核信號(hào)因子,還與質(zhì)體發(fā)育有關(guān)。ChlH是鎂螯合酶的亞基之一,還可以作為質(zhì)體-細(xì)胞核信號(hào)因子并被GUN4激活。這些結(jié)果表明烏塌菜中高表達(dá)水平的ChlH和GU

10、N4可以一起作為質(zhì)體-細(xì)胞核信號(hào)因子來(lái)調(diào)控葉綠素合成以及質(zhì)體發(fā)育,可能是導(dǎo)致烏塌菜葉片中葉綠素含量高,類(lèi)囊體膜系統(tǒng)高度發(fā)達(dá)的原因。
　　(4)根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,克隆了蕓薹屬植物中的一些與葉綠素積累相關(guān)的基因并進(jìn)行了分析:
　　在羽衣甘藍(lán)白鴿、綠鴿和小白菜中分別獲得了CISC的全長(zhǎng)cDNA,都包含了2220bp的開(kāi)放閱讀框,并各自編碼了739個(gè)氨基酸殘基。蛋白質(zhì)序列比對(duì)的結(jié)果顯示,羽衣甘藍(lán)白鴿BoCISCw和綠鴿BoCISC

11、g的蛋白質(zhì)序列是完全一致的,并且與小白菜BrCISCp以及擬南芥AtCISC具有很高的同源性。
　　在羽衣甘藍(lán)白鴿和綠鴿中分別獲得了RCA的全長(zhǎng)cDNA,都包含了1317bp的開(kāi)放閱讀框,并編碼了438個(gè)氨基酸殘基。蛋白質(zhì)序列比對(duì)的結(jié)果顯示,RCA基因編碼的蛋白質(zhì)序列在羽衣甘藍(lán)白鴿和綠鴿中只有兩個(gè)氨基酸的差異。
　　在羽衣甘藍(lán)白鴿、綠鴿、小白菜和烏塌菜中分別獲得了DET1的全長(zhǎng)cDNA,分別包含了1611bp、1611bp、

12、1614bp和1608bp的開(kāi)放閱讀框,并各自編碼了536、536、537和535個(gè)氨基酸殘基。蛋白質(zhì)序列比對(duì)的結(jié)果顯示,DET1基因編碼的蛋白質(zhì)序列在羽衣甘藍(lán)白鴿和綠鴿中是完全一致的,而在小白菜和烏塌菜中只有兩個(gè)氨基酸的差異。
　　在羽衣甘藍(lán)白鴿、綠鴿、小白菜和烏塌菜中分別獲得了GUN4的全長(zhǎng)cDNA,分別包含了771bp、771bp、771bp和783bp的開(kāi)放閱讀框,并各自編碼了256、256、256和260個(gè)氨基酸殘基。蛋

13、白質(zhì)序列比對(duì)的結(jié)果顯示,GUN4基因編碼的蛋白質(zhì)序列在羽衣甘藍(lán)白鴿和綠鴿中是完全一致的,并且與小白菜BrGUN4p只有一個(gè)氨基酸的差異。而烏塌菜BrGUN4w的蛋白質(zhì)序列與羽衣甘藍(lán)BoGUN4及小白菜BrGUN4p差異較大,有7個(gè)保守氨基酸發(fā)生了突變。經(jīng)生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),烏塌菜BrGUN4w的等電點(diǎn)、疏水性等理化性質(zhì)和羽衣甘藍(lán)BoGUN4、小白菜BrGUN4p相比,都發(fā)生了改變。尤其值得注意的是,烏塌菜BrGUN4w的磷酸化位點(diǎn)和三