兩種斑馬魚原始造血髓系細胞突變體的研究.pdf

1、研究背景：
　　 造血系統(tǒng)在胚胎發(fā)生、器官形成、機體防御以及組織修復等生命活動過程中發(fā)揮著至關重要的作用,脊椎動物的造血大致分為原始造血和定向造血兩個階段,其典型特點是腹側中胚層的多功能干細胞,經一系列誘導、增殖和分化之后,發(fā)育成成熟的各血細胞譜系。髓系造血是整個造血過程的重要組成部分,髓系細胞主要分為多核細胞系和單核細胞系兩大類,多核吞噬細胞主要由中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞組成,在病原體入侵和組織損害時發(fā)

2、揮著重要的免疫防御作用；單核吞噬細胞系統(tǒng)由循環(huán)中的巨噬細胞、枝狀細胞、和組織定居細胞(骨組織中的破骨細胞,腦中的小膠質細胞,肝臟中的Kupffer細胞)組成,不僅在免疫應答中發(fā)揮著重要作用,而且參與器官形成和組織修復。髓系細胞的起源、增殖、遷徙和分化受到多種轉錄因子、生長因子及其受體的嚴格調控,癌癥發(fā)生、免疫失調和神經功能紊亂與髓系細胞發(fā)育失調關系密切,所以對造血過程各階段調控機制的明確有著重要的意義。由于造血系統(tǒng)的發(fā)育大多在胚胎時期完

3、成,傳統(tǒng)模式生物小鼠的胚胎子宮內發(fā)育給早期造血階段的研究帶來不便。新型模式生物斑馬魚可成為研究造血系統(tǒng)發(fā)育的最佳模式生物,首先作為脊椎動物,它與人類有較高的同源性,同時調節(jié)造血系統(tǒng)的分子通路是相當保守的；其次它的胚胎體外發(fā)育且透明,便于進行試驗研究。
　　 斑馬魚的造血過程與哺乳動物極為相似,在原始造血階段,髓系前體細胞起源于前側中胚層(ALM)的喙周血島(RBI),在3-5個體節(jié)時在RBI區(qū)域可檢測到髓系特異性轉錄因子pu.l

4、的表達,在11-15個體節(jié)時,巨噬細胞前體細胞向頭部正中線遷徙,在眼睛和心周形成局部聚集的細胞團塊,繼而逆向運動,橫向遷徙,分散成單個細胞穿過卵黃囊,最終通過居維葉氏管(胚胎期開口于心耳的兩個短的靜脈)進入血液循環(huán),在受精后26小時(26hpf)后可檢測到功能性巨噬細胞；斑馬魚的粒細胞主要是嗜中性粒細胞,主要來自于中央細胞團塊(ICM)靠尾部的區(qū)域,RBI區(qū)域也可形成,受精后48小時(48hpf)在血液循環(huán)系統(tǒng)和疏松結締組織均可檢測到功

5、能成熟的中性粒細胞。原始紅系與髓系分化平行,產生于ICM區(qū)域。定向造血與26-48hpf開始于背主動脈腹側壁(VDA),相當于哺乳動物主動脈-性腺-中腎(AGM)區(qū)域,受精后3天(3dpf)尾部造血組織(CHT)成為過渡性造血器官,相當于哺乳動物的胎肝,最終于5dpf在腎臟建立永久造血器官,相當于哺乳動物的骨髓。定向造血階段主要產生造血干細胞,造血干細胞再進一步分化成熟為各血細胞譜系。
　　 再者,斑馬魚還具有體積小,生長周期短

6、,繁殖能力強等優(yōu)點,非常適合化學誘變大規(guī)模正向遺傳學篩選,可分離突變基因組,找到造血系統(tǒng)功能單一的基因缺陷突變體。本研究采用經典的N-乙基-亞硝基脲(N-ethylN-nitrosourea,ENU)化學誘變,收集F3代胚胎,進行中性紅和蘇丹黑B細胞化學染色,可篩選髓系細胞異常的突變體,通過對已得突變體的進一步研究,有望了解原始造血階段髓系細胞的起源、增殖、遷徙、分化的具體過程以及調控機制。
　　 本研究由三個部分組成:第一部分

7、 N-乙基-亞硝基脲(N—ethylN-nitrosourea,ENU)化學誘變及正向遺傳學篩選；第二部分斑馬魚原始造血巨噬細胞突變體1276的表型鑒定及性狀分析；第三部分斑馬魚原始造血中性粒細胞突變體1038的表型鑒定及性狀分析。
　　 第一部分ENU化學誘變及正向遺傳學篩選
　　 1.目的：
　　 利用化學誘變劑ENU飽和誘變AB野生型斑馬魚基因組,然后對突變基因組進行正向遺傳學篩選,篩選斑馬魚原始造血髓系細

8、胞突變體。
　　 2.方法
　　 利用化學誘變劑ENU誘變野生型AB斑馬魚雄魚的精原細胞,突變基因組保留傳代,采用中性紅染液和蘇丹黑B染液對F3代的胚胎進行細胞化學染色,篩選原始造血髓系細胞突變體。
　　 3.結果
　　 成功篩選1800個F2家族,2952個突變基因組,發(fā)現中性紅染色信號異常突變體10個,蘇丹黑B染色信號異常突變體26個,兩者均異常的突變體2個。
　　 4結論
　　 EN

9、U化學誘變試驗設計合理,細胞化學染色方法是一種簡單、高效、易行的篩選方法。
　　 第二部分斑馬魚原始造血巨噬細胞突變體1276的表型鑒定及性狀分析
　　 1.目的
　　 對斑馬魚原始造血巨噬細胞突變體1276進行表型鑒定及性狀分析
　　 2.方法
　　 采用中性紅和蘇丹黑B細胞化學染色方法對髓系細胞進行功能學評估,通過檢測不同譜系血細胞標記基因(apoe、l-plastin、lyc、βel、rag

10、l、c-myb)在不同發(fā)育階段的mRNA及蛋白的表達水平,來界定巨噬細胞在來源、增殖、遷徙、組織定居哪一過程存在異常。
　　 3.結果
　　 突變體1276在原始造血階段,中性紅染色全身信號缺失,小膠質細胞標記基因apoe表達缺失,巨噬細胞標記基因l-plastin,頭部表達減少,背主動脈壁腹側(VDA)區(qū)域表達正常,粒細胞、紅細胞均未見異常;在定向造血階段,巨噬細胞仍存在異常,但粒細胞、紅細胞、淋巴細胞以及造血干細胞均

11、未見明顯異常。
　　 4.結論
　　 突變體1276在原始造血階段,巨噬細胞存在功能障礙,以及不同程度發(fā)育及遷徙異常；在定向造血階段這一性狀并未得到代償。
　　 第三部分斑馬魚原始造血中性粒細胞突變體1038的表型鑒定及性狀分析
　　 1.目的
　　 對斑馬魚原始造血中性粒細胞突變體1038進行表型鑒定和性狀分析
　　 2.方法
　　 采用蘇丹黑B和中性紅細胞化學染色方法對髓系細胞

12、進行功能學評估,通過檢測不同譜系血細胞標記基因(mpo、lyc、βel、ragl、c-myb)在不同發(fā)育階段的mRNA的表達水平,來界定中性粒細胞在來源、增殖、遷徙、功能成熟哪一過程存在異常。
　　 3.結果
　　 突變體1038在原始造血階段和永久造血階段,蘇丹黑B染色都是全身未見信號陽性細胞,2 dpf和5 dpf的中性粒細胞標記基因mpo的表達均明顯減少,而另一個中性粒細胞標記基因lyc表達正常且中性紅染色可見陽性