兩種斑馬魚(yú)原始造血髓系細(xì)胞突變體的研究.pdf

1、研究背景：
　　 造血系統(tǒng)在胚胎發(fā)生、器官形成、機(jī)體防御以及組織修復(fù)等生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,脊椎動(dòng)物的造血大致分為原始造血和定向造血兩個(gè)階段,其典型特點(diǎn)是腹側(cè)中胚層的多功能干細(xì)胞,經(jīng)一系列誘導(dǎo)、增殖和分化之后,發(fā)育成成熟的各血細(xì)胞譜系。髓系造血是整個(gè)造血過(guò)程的重要組成部分,髓系細(xì)胞主要分為多核細(xì)胞系和單核細(xì)胞系兩大類(lèi),多核吞噬細(xì)胞主要由中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞組成,在病原體入侵和組織損害時(shí)發(fā)

2、揮著重要的免疫防御作用；單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)由循環(huán)中的巨噬細(xì)胞、枝狀細(xì)胞、和組織定居細(xì)胞(骨組織中的破骨細(xì)胞,腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞,肝臟中的Kupffer細(xì)胞)組成,不僅在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用,而且參與器官形成和組織修復(fù)。髓系細(xì)胞的起源、增殖、遷徙和分化受到多種轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子及其受體的嚴(yán)格調(diào)控,癌癥發(fā)生、免疫失調(diào)和神經(jīng)功能紊亂與髓系細(xì)胞發(fā)育失調(diào)關(guān)系密切,所以對(duì)造血過(guò)程各階段調(diào)控機(jī)制的明確有著重要的意義。由于造血系統(tǒng)的發(fā)育大多在胚胎時(shí)期完

3、成,傳統(tǒng)模式生物小鼠的胚胎子宮內(nèi)發(fā)育給早期造血階段的研究帶來(lái)不便。新型模式生物斑馬魚(yú)可成為研究造血系統(tǒng)發(fā)育的最佳模式生物,首先作為脊椎動(dòng)物,它與人類(lèi)有較高的同源性,同時(shí)調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)的分子通路是相當(dāng)保守的；其次它的胚胎體外發(fā)育且透明,便于進(jìn)行試驗(yàn)研究。
　　 斑馬魚(yú)的造血過(guò)程與哺乳動(dòng)物極為相似,在原始造血階段,髓系前體細(xì)胞起源于前側(cè)中胚層(ALM)的喙周血島(RBI),在3-5個(gè)體節(jié)時(shí)在RBI區(qū)域可檢測(cè)到髓系特異性轉(zhuǎn)錄因子pu.l

4、的表達(dá),在11-15個(gè)體節(jié)時(shí),巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞向頭部正中線遷徙,在眼睛和心周形成局部聚集的細(xì)胞團(tuán)塊,繼而逆向運(yùn)動(dòng),橫向遷徙,分散成單個(gè)細(xì)胞穿過(guò)卵黃囊,最終通過(guò)居維葉氏管(胚胎期開(kāi)口于心耳的兩個(gè)短的靜脈)進(jìn)入血液循環(huán),在受精后26小時(shí)(26hpf)后可檢測(cè)到功能性巨噬細(xì)胞；斑馬魚(yú)的粒細(xì)胞主要是嗜中性粒細(xì)胞,主要來(lái)自于中央細(xì)胞團(tuán)塊(ICM)靠尾部的區(qū)域,RBI區(qū)域也可形成,受精后48小時(shí)(48hpf)在血液循環(huán)系統(tǒng)和疏松結(jié)締組織均可檢測(cè)到功

5、能成熟的中性粒細(xì)胞。原始紅系與髓系分化平行,產(chǎn)生于ICM區(qū)域。定向造血與26-48hpf開(kāi)始于背主動(dòng)脈腹側(cè)壁(VDA),相當(dāng)于哺乳動(dòng)物主動(dòng)脈-性腺-中腎(AGM)區(qū)域,受精后3天(3dpf)尾部造血組織(CHT)成為過(guò)渡性造血器官,相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的胎肝,最終于5dpf在腎臟建立永久造血器官,相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的骨髓。定向造血階段主要產(chǎn)生造血干細(xì)胞,造血干細(xì)胞再進(jìn)一步分化成熟為各血細(xì)胞譜系。
　　 再者,斑馬魚(yú)還具有體積小,生長(zhǎng)周期短

6、,繁殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),非常適合化學(xué)誘變大規(guī)模正向遺傳學(xué)篩選,可分離突變基因組,找到造血系統(tǒng)功能單一的基因缺陷突變體。本研究采用經(jīng)典的N-乙基-亞硝基脲(N-ethylN-nitrosourea,ENU)化學(xué)誘變,收集F3代胚胎,進(jìn)行中性紅和蘇丹黑B細(xì)胞化學(xué)染色,可篩選髓系細(xì)胞異常的突變體,通過(guò)對(duì)已得突變體的進(jìn)一步研究,有望了解原始造血階段髓系細(xì)胞的起源、增殖、遷徙、分化的具體過(guò)程以及調(diào)控機(jī)制。
　　 本研究由三個(gè)部分組成:第一部分

7、 N-乙基-亞硝基脲(N—ethylN-nitrosourea,ENU)化學(xué)誘變及正向遺傳學(xué)篩選；第二部分斑馬魚(yú)原始造血巨噬細(xì)胞突變體1276的表型鑒定及性狀分析；第三部分斑馬魚(yú)原始造血中性粒細(xì)胞突變體1038的表型鑒定及性狀分析。
　　 第一部分ENU化學(xué)誘變及正向遺傳學(xué)篩選
　　 1.目的：
　　 利用化學(xué)誘變劑ENU飽和誘變AB野生型斑馬魚(yú)基因組,然后對(duì)突變基因組進(jìn)行正向遺傳學(xué)篩選,篩選斑馬魚(yú)原始造血髓系細(xì)

8、胞突變體。
　　 2.方法
　　 利用化學(xué)誘變劑ENU誘變野生型AB斑馬魚(yú)雄魚(yú)的精原細(xì)胞,突變基因組保留傳代,采用中性紅染液和蘇丹黑B染液對(duì)F3代的胚胎進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色,篩選原始造血髓系細(xì)胞突變體。
　　 3.結(jié)果
　　 成功篩選1800個(gè)F2家族,2952個(gè)突變基因組,發(fā)現(xiàn)中性紅染色信號(hào)異常突變體10個(gè),蘇丹黑B染色信號(hào)異常突變體26個(gè),兩者均異常的突變體2個(gè)。
　　 4結(jié)論
　　 EN

9、U化學(xué)誘變?cè)囼?yàn)設(shè)計(jì)合理,細(xì)胞化學(xué)染色方法是一種簡(jiǎn)單、高效、易行的篩選方法。
　　 第二部分斑馬魚(yú)原始造血巨噬細(xì)胞突變體1276的表型鑒定及性狀分析
　　 1.目的
　　 對(duì)斑馬魚(yú)原始造血巨噬細(xì)胞突變體1276進(jìn)行表型鑒定及性狀分析
　　 2.方法
　　 采用中性紅和蘇丹黑B細(xì)胞化學(xué)染色方法對(duì)髓系細(xì)胞進(jìn)行功能學(xué)評(píng)估,通過(guò)檢測(cè)不同譜系血細(xì)胞標(biāo)記基因(apoe、l-plastin、lyc、βel、rag

10、l、c-myb)在不同發(fā)育階段的mRNA及蛋白的表達(dá)水平,來(lái)界定巨噬細(xì)胞在來(lái)源、增殖、遷徙、組織定居哪一過(guò)程存在異常。
　　 3.結(jié)果
　　 突變體1276在原始造血階段,中性紅染色全身信號(hào)缺失,小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記基因apoe表達(dá)缺失,巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因l-plastin,頭部表達(dá)減少,背主動(dòng)脈壁腹側(cè)(VDA)區(qū)域表達(dá)正常,粒細(xì)胞、紅細(xì)胞均未見(jiàn)異常;在定向造血階段,巨噬細(xì)胞仍存在異常,但粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及造血干細(xì)胞均

11、未見(jiàn)明顯異常。
　　 4.結(jié)論
　　 突變體1276在原始造血階段,巨噬細(xì)胞存在功能障礙,以及不同程度發(fā)育及遷徙異常；在定向造血階段這一性狀并未得到代償。
　　 第三部分斑馬魚(yú)原始造血中性粒細(xì)胞突變體1038的表型鑒定及性狀分析
　　 1.目的
　　 對(duì)斑馬魚(yú)原始造血中性粒細(xì)胞突變體1038進(jìn)行表型鑒定和性狀分析
　　 2.方法
　　 采用蘇丹黑B和中性紅細(xì)胞化學(xué)染色方法對(duì)髓系細(xì)胞

12、進(jìn)行功能學(xué)評(píng)估,通過(guò)檢測(cè)不同譜系血細(xì)胞標(biāo)記基因(mpo、lyc、βel、ragl、c-myb)在不同發(fā)育階段的mRNA的表達(dá)水平,來(lái)界定中性粒細(xì)胞在來(lái)源、增殖、遷徙、功能成熟哪一過(guò)程存在異常。
　　 3.結(jié)果
　　 突變體1038在原始造血階段和永久造血階段,蘇丹黑B染色都是全身未見(jiàn)信號(hào)陽(yáng)性細(xì)胞,2 dpf和5 dpf的中性粒細(xì)胞標(biāo)記基因mpo的表達(dá)均明顯減少,而另一個(gè)中性粒細(xì)胞標(biāo)記基因lyc表達(dá)正常且中性紅染色可見(jiàn)陽(yáng)性