藍(lán)細(xì)菌光敏色素結(jié)構(gòu)域體內(nèi)重組及光學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、植物光敏色素是一種光受體，含有線性四吡咯生色團(tuán)的水溶性蛋白質(zhì)，具有可逆光轉(zhuǎn)換效應(yīng)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)光敏色素也存在于細(xì)菌和真菌中。藍(lán)細(xì)菌光敏色素是一類(lèi)共價(jià)結(jié)合藻膽色素發(fā)色團(tuán)的光譜多變的光受體家族，它們的光譜變化幾乎覆蓋了近紫外/可見(jiàn)光區(qū)，與植物光敏色素有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，且只存在于藍(lán)細(xì)菌內(nèi)。藍(lán)細(xì)菌光敏色素還可能涉及到晝夜節(jié)律和細(xì)胞聚集的光感應(yīng)重新組合。研究表明，單獨(dú)的GAF結(jié)構(gòu)域與生成藻膽色素的基因在大腸桿菌中共表達(dá)，可獲得與藍(lán)細(xì)菌光敏色素全

2、蛋白的光化學(xué)性質(zhì)相似的色素蛋白。
　　 Thermosynechococcus elongatus BP-1中含有藍(lán)細(xì)菌光敏色素?cái)?shù)量比較少，且它們是熱穩(wěn)定的，通過(guò)蛋白質(zhì)序列同源性比對(duì)分析，在它里面找到了與已知的Pb/Pg型藍(lán)細(xì)菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的4個(gè)基因tll0899、tlr0911、tlr1215和tlr1999。通過(guò)分子克隆技術(shù)把它們的GAF結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建在pET30a(+)表達(dá)載體上，與質(zhì)粒pA

3、CYCDuet-ho1-pcyA在大腸桿菌體內(nèi)重組生成重組蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Tll0899-GAF具有光化學(xué)活性可共價(jià)結(jié)合藻藍(lán)膽素(PCB)，Tlr0911-GAF存在藍(lán)光吸收態(tài)Pb406nm和綠光吸收態(tài)Pg527nm之間的可逆光轉(zhuǎn)換，Tlr1999-GAF則存在藍(lán)光吸收態(tài)Pb417nm和青光吸收態(tài)Pt496nm之間的可逆光轉(zhuǎn)換，它們均共價(jià)結(jié)合兩種藻膽色素，即藻紫膽素(PVB)和藻藍(lán)膽素(PCB)，Tlr0911-GAF和Tlr199

4、9-GAF均在藍(lán)光區(qū)和綠光區(qū)有吸收可稱(chēng)之為藍(lán)/綠光受體。該實(shí)驗(yàn)表明Tlr0911和Tlr1999的GAF結(jié)構(gòu)域可能具有3個(gè)活性功能，即為自催化裂合酶活性，自催化異構(gòu)酶活性，光致異構(gòu)化活性。而Tlr1215-GAF1和Tlr1215-GAF2不能自發(fā)結(jié)合藻膽色素，不具有光化學(xué)活性。
　　 在對(duì)Synechococcus sp.CC9311中僅有的兩個(gè)推測(cè)的藍(lán)細(xì)菌光敏色素Sync_0012和Sync_1604研究中，將它們的GAF結(jié)

5、構(gòu)域分別構(gòu)建在pET30a(+)表達(dá)載體上，單獨(dú)誘導(dǎo)表達(dá)或與質(zhì)粒pACYCDuet-ho1-pcyA在大腸桿菌體內(nèi)重組后表達(dá)，得到水溶性較低的蛋白質(zhì)，通過(guò)加入尿素促溶，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，Sync_0012-GAF和Sync_1604-GAF不能與藻膽色素共價(jià)結(jié)合，但是它們可能與核黃素等大腸桿菌體內(nèi)的色素結(jié)合，這還需要進(jìn)一步的研究。
　　 根據(jù)Nostoc sp.PCC7120中所有的GAF結(jié)構(gòu)域氨基酸序列信息進(jìn)行蛋白質(zhì)聚類(lèi)分析，利用

6、生物軟件Clustal X1.83和MEGA version5.0做出Nostoc sp.PCC7120中 GAF結(jié)構(gòu)域進(jìn)化樹(shù)示意圖，發(fā)現(xiàn)一個(gè)含有保守性的DXCF基序的光受體分支，以及其它一些同源性較高的光受體分支。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建GAF結(jié)構(gòu)域的表達(dá)質(zhì)粒，分別將各種表達(dá)質(zhì)粒與催化藻藍(lán)色素生物合成的質(zhì)粒pACYCDuet-ho1-pcyA同時(shí)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21體內(nèi)重組，誘導(dǎo)表達(dá)生成重組蛋白。發(fā)現(xiàn)2個(gè)具有可逆光轉(zhuǎn)換效應(yīng)的含DXCF基

7、序的藍(lán)細(xì)菌光敏色素All1688和Alr1966，All1688-GAF主要結(jié)合PCB，其可逆光轉(zhuǎn)換效應(yīng)比較微弱，它的Pg態(tài)和Pb態(tài)的吸收光譜具有重疊現(xiàn)象;Alr1966-GAF2共價(jià)結(jié)合PVB和PCB，有3種光狀態(tài):Pg態(tài)、中間態(tài)和Pb態(tài)，它具有順序光可逆循環(huán)。另一個(gè)由All4978-GAF、All7016-GAF和Alr7522-GAF組成的光受體分支，其中Alr7522-GAF不具有光化學(xué)活性，而其余2個(gè)具有性質(zhì)相似的光化學(xué)活性，

8、但是不具備可逆光轉(zhuǎn)換效應(yīng)，根據(jù)其吸收光譜推測(cè)它們結(jié)合的色素可能為血紅素。
　　 通過(guò)蛋白質(zhì)序列同源性和相似性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)Synechocystis sp.PCC6803中sll1888、sll1228、sll1124基因編碼的蛋白質(zhì)分別與Slr1393、Sll0041、UirS(基因?yàn)閟lr1212)具有同源性。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建這3個(gè)基因GAF結(jié)構(gòu)域的表達(dá)質(zhì)粒，分別將表達(dá)質(zhì)粒與質(zhì)粒pACYCDuet-ho1-pcyA同時(shí)