顆粒裂解抗菌結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的重組表達(dá).pdf

1、近年來，伴隨著細(xì)菌耐藥性問題的日趨嚴(yán)峻，對(duì)新型抗感染藥物的需求十分迫切，因此尋找傳統(tǒng)抗生素的替代品顯得越來越重要?？咕氖且活愑缮矬w產(chǎn)生的具有抗菌活性的小分子多肽的總稱。自其發(fā)現(xiàn)以來，人們已經(jīng)相繼獲得了上千種具有不同抗菌活性的抗菌肽及其類似物。它們作為一類新型的抗菌物質(zhì)，廣泛分布于從低等生物到高等動(dòng)植物的各種生物體中，越來越多的研究表明抗菌肽在宿主天然性免疫中發(fā)揮著重要的作用。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽獨(dú)特的抗菌機(jī)理使其有望發(fā)展成為一種

2、新型的抗菌藥物，其潛在的應(yīng)用價(jià)值也已經(jīng)受到人們的普遍關(guān)注。
　　 顆粒裂解肽（Granulysin）與NK-lysin分別是人源性和豬源性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）以及自然殺傷細(xì)胞（NK）內(nèi)含有的陽離子型抗菌肽，都是脂結(jié)合蛋白SAPLIP (saposin-like protein)家族成員之一。兩者序列結(jié)構(gòu)相似度為67％，空間結(jié)構(gòu)均由五個(gè)α-螺旋（H1-H5結(jié)構(gòu)域）經(jīng)loop連接而成，且都具有抗菌活性。G13結(jié)構(gòu)域是Gra

3、nulysin中由19個(gè)氨基酸殘基組成的一個(gè)肽段，可抑制真菌和細(xì)菌的活性，但對(duì)脂質(zhì)體和動(dòng)物細(xì)胞沒有毒性。NKLF-2結(jié)構(gòu)域是NK-lysin中由22個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽段，對(duì)結(jié)核分枝桿菌有直接的細(xì)胞毒性，且不會(huì)引起溶血反應(yīng)。
　　 本研究主要采用兩種不同策略分別探討G13與NKLF-2結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的表達(dá)。一種是通過設(shè)計(jì)共表達(dá)策略來抑制目標(biāo)陽離子抗菌肽對(duì)宿主菌的毒性作用，以實(shí)現(xiàn)抗菌結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的高效表達(dá)。該方法主要是通

4、過將一段編碼陰離子配體的DNA序列與陽離子抗菌肽基因分別設(shè)計(jì)插入到pACYCDuet-1載體的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)中。構(gòu)建的共表達(dá)型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)共表達(dá)。結(jié)果證明該方法可有效提高陽離子抗菌肽的表達(dá)產(chǎn)量。從而為抗菌肽的深入研究和開發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的生產(chǎn)方法奠定基礎(chǔ)。
　　 另外一種提高抗菌肽原核表達(dá)效率的策略是，在不改變目標(biāo)抗菌肽氨基酸序列的前提下，根據(jù)需要對(duì)mRNA翻譯起始區(qū)（TIR）核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化突變