MultiBac高效展示系統(tǒng)建立及VSV-G融合修飾的應(yīng)用研究.pdf

1、桿狀病毒表面展示系統(tǒng)是近年來(lái)快速發(fā)展的一種真核生物表面展示系統(tǒng)，其主要原理是將外源基因與囊膜蛋白基因進(jìn)行融合，導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行融合表達(dá)，使外源蛋白在囊膜蛋白的介導(dǎo)下展示在重組桿狀病毒囊膜或被感染的細(xì)胞膜表面。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)具有病毒滴度高、外源基因容納能力大、翻譯后修飾機(jī)制完善等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于基因呈遞、癌細(xì)胞靶向攻擊、單克隆抗體制備和新型多價(jià)疫苗研發(fā)等領(lǐng)域。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)中，常使用GroupⅠ型桿狀病毒的GP64介導(dǎo)外源

2、蛋白的融合展示，該蛋白具有分布極性，其受體位點(diǎn)僅存在于桿狀病毒囊膜極性區(qū)域。病毒復(fù)制周期中，野生型GP64蛋白常與GP64融合蛋白之間發(fā)生強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，引起桿狀病毒表面展示效率低等缺點(diǎn)。
　　為了有效解決桿狀病毒的表面展示和基因呈遞效率低等缺陷，本研究利用細(xì)菌內(nèi)同源重組、雙熒光素酶檢測(cè)，Westren Blot鑒定和激光共聚焦斷層掃描等技術(shù)，分別開展了突變型rSw106-inv菌株（Ac-Zeo-ph\Δp64）的構(gòu)建、Ac-

3、Zeo-ph\Δp64應(yīng)用于重組桿狀病毒的復(fù)制周期研究、Ac-Zeo-ph\Δp64應(yīng)用于重組桿狀病毒的表面展示效率檢測(cè)和Ac-Zeo-ph\Δp64進(jìn)行VSV-G介導(dǎo)的融合展示等研究，獲得如下結(jié)果：
　　1）Ac-Zeo-ph\Δp64的構(gòu)建
　　利用over-lap PCR技術(shù)構(gòu)建出同源重組片段，電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入Invasin介導(dǎo)的DAP缺陷型Sw106受體菌E.coliAcMultiBac/Δasd Sw106/PGB2ΩI

4、nv（野生型rSw106-inv菌株Ac），完成細(xì)菌內(nèi)Red同源重組過程，成功構(gòu)建了延遲rAcMultiBac中g(shù)p64基因表達(dá)的突變型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-ph\Δp64。
　　2）Ac-Zeo-ph\Δp64應(yīng)用于重組桿狀病毒的復(fù)制周期研究
　　對(duì)突變型rAcMultiBac進(jìn)行延遲表達(dá)野生型GP64蛋白等研究，結(jié)果表明延遲表達(dá)野生型GP64蛋白對(duì)重組桿狀病毒復(fù)制周期無(wú)明顯影響。
　　3）Ac-Ze

5、o-ph\Δp64應(yīng)用于重組桿狀病毒的展示效率檢測(cè)
　　將海腎熒光素酶報(bào)告基因和 gp64基因進(jìn)行融合，利用螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因作為內(nèi)參基因，共同導(dǎo)入突變型 rAcMultiBac，雙熒光素酶檢測(cè)技術(shù)對(duì)重組桿狀病毒的表面展示效率進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，應(yīng)用突變型 rSw106-inv菌株 Ac-Zeo-ph\Δp64構(gòu)建的重組桿狀病毒可將表面展示效率提高約0.8倍。
　　4）應(yīng)用Ac-Zeo-ph\Δp64開展VSV-G介導(dǎo)的

6、融合展示研究
　　vsv-g基因的密碼子使用偏好性分析結(jié)果表明，vsv-g基因在sf9細(xì)胞中具有較好的表達(dá)效果。利用Ac-Zeo-ph\Δp64成功構(gòu)建了VSV-G介導(dǎo)的egfp展示重組桿狀病毒。激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明，VSV-G介導(dǎo)的外源蛋白均成功的展示在sf9細(xì)胞膜表面，Western Blot鑒定結(jié)果表明外源蛋白成功組裝至子代桿狀病毒。
　　該研究成功構(gòu)建了可應(yīng)用于桿狀病毒多基因高效展示系統(tǒng)的菌株平臺(tái)，均有效