瘤胃內(nèi)高效產(chǎn)氨菌檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、反芻動(dòng)物的氮排泄不僅造成日糧中蛋白質(zhì)的損失，還造成了環(huán)境污染，因此近年來有關(guān)如何降低反芻動(dòng)物的氮排泄，提高日糧蛋白質(zhì)的利用效率越來越受到關(guān)注。瘤胃高效產(chǎn)氨菌作為一種快速產(chǎn)氨的瘤胃細(xì)菌，在反芻動(dòng)物瘤胃蛋白質(zhì)分解和氮排泄過程中可能起著重要的作用，本研究建立了瘤胃高效產(chǎn)氨菌Real-timePCR檢測(cè)方法，成功對(duì)瘤胃高效產(chǎn)氨菌進(jìn)行定量，為今后研究日糧對(duì)高效產(chǎn)氨菌數(shù)量的影響奠定理論基礎(chǔ)。同時(shí)還研究了酪蛋白水解物以及4種植物提取物對(duì)瘤胃體外發(fā)酵及

2、瘤胃主要微生物數(shù)量的影響，初步探討高效產(chǎn)氨菌的數(shù)量與瘤胃氨態(tài)氮生成的關(guān)系。
　　試驗(yàn)一瘤胃中高效產(chǎn)氨菌絕對(duì)定量PCR方法的建立。本試驗(yàn)通過GenBank查找Clostridium aminophilum的16S rRNA序列，利用PRISE軟件設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物送出測(cè)序，檢測(cè)引物的特異性，通過GenBank上的BLAST將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列的同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Clostridium aminophilum的陽性克隆的測(cè)序

3、與GenBank上已知目的菌種序列相似性為100％。通過厭氧培養(yǎng)、活化目的菌株、提取目的菌株的DNA成功建立了高效產(chǎn)氨菌（C.aminophilum）的Real-timePCR絕對(duì)定量方法，結(jié)果表明所制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很高的相關(guān)性(R2＞0.99)，擴(kuò)增效率為96.45％，符合Real-time PCR定量的要求。以玉米和羊草(1∶1)0.5g為發(fā)酵底物，梯度添加酪蛋白水解物，三個(gè)重復(fù)，39℃體外發(fā)酵24h后檢測(cè)瘤胃高效產(chǎn)氨菌的數(shù)量，結(jié)

4、果顯示，瘤胃高效產(chǎn)氨菌的數(shù)量隨酪蛋白水解物的梯度添加而增加，所設(shè)計(jì)的引物可以用于后續(xù)試驗(yàn)樣品中目的菌株的準(zhǔn)確定量。
　　試驗(yàn)二瘤胃中高效產(chǎn)氨菌檢測(cè)方法在體外產(chǎn)氣試驗(yàn)中的應(yīng)用。本試驗(yàn)采用壓力傳感器式體外產(chǎn)氣系統(tǒng)，以玉米和羊草(1∶1，DM)0.5g為發(fā)酵底物，梯度添加酪蛋白水解物，三個(gè)重復(fù)，39℃體外發(fā)酵24h后研究酪蛋白水解物對(duì)瘤胃發(fā)酵和瘤胃高效產(chǎn)氨菌的數(shù)量的影響。結(jié)果顯示，瘤胃高效產(chǎn)氨菌的數(shù)量隨酪蛋白水解物濃度的升高而增加。

5、r>　　同時(shí)本試驗(yàn)采用壓力傳感器式體外產(chǎn)氣系統(tǒng)，以玉米和羊草(1∶1，DM)0.5g為發(fā)酵底物，分別將薄荷油、百里香油、樟腦油和冬青油以300 mg/L的水平添加到體外發(fā)酵液中，添加12mg/L的莫能霉素鈉作為正對(duì)照，空白對(duì)照添加相同體積的無水乙醇，三個(gè)重復(fù)，39℃體外發(fā)酵24h后研究植物提取物對(duì)瘤胃發(fā)酵和微生物菌群的影響。結(jié)果表明，冬青油處理組與空白對(duì)照相比顯著提高了產(chǎn)氣量（P＜0.01），薄荷油、百里香油和莫能霉素鈉處理組與空白對(duì)照

6、相比顯著降低了產(chǎn)氣量（P＜0.01），樟腦油處理組與空白對(duì)照相比對(duì)產(chǎn)氣量無顯著影響;薄荷油和百里香油處理組與空白對(duì)照相比顯著降低了總VFA的濃度（P＜0.01），其他2種揮發(fā)油和莫能霉素鈉處理組與空白對(duì)照相比對(duì)總VFA的濃度無顯著影響;薄荷油、百里香油和莫能霉素鈉處理組與空白對(duì)照相比顯著降低了氨態(tài)氮的濃度(P＜0.01)，其他兩種揮發(fā)油處理組與空白對(duì)照相比對(duì)氨態(tài)氮的濃度無顯著影響;與空白對(duì)照相比，4種揮發(fā)油和莫能霉素鈉都不影響瘤胃微生物

7、蛋白的濃度;樟腦油處理組與空白對(duì)照相比顯著提高了乙酸丙酸的比例（P＜0.01）。由試驗(yàn)結(jié)果得出，樟腦油相對(duì)于其它3種揮發(fā)油具有較好的添加效果。樟腦油可以改變瘤胃的發(fā)酵模式，從而促進(jìn)日糧能量的利用。
　　取上述體外產(chǎn)氣試驗(yàn)瘤胃液樣品1 mL，采用絕對(duì)定量的方法測(cè)定瘤胃液中總菌、真菌、普雷沃氏菌、高效產(chǎn)氨菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量。結(jié)果顯示，4種揮發(fā)油的添加對(duì)瘤胃總菌、瘤胃真菌、黃色瘤胃球菌

8、和高效產(chǎn)氨菌的數(shù)量均未產(chǎn)生顯著影響;薄荷油、百里香油和冬青油顯著降低了普雷沃氏菌的數(shù)量(P＜0.05)，薄荷油、百里香油、樟腦油和冬青油顯著降低了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量(P＜0.01)，百里香油和冬青油顯著降低了白色瘤胃球菌的數(shù)量(P＜0.05)，薄荷油、百里香油和冬青油顯著降低了嗜淀粉瘤胃桿菌的數(shù)量(P＜0.01)。
　　綜上所述，薄荷油、百里香油和冬青油處理組纖維分解菌數(shù)量的顯著降低與它們體外發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)氣量和總VFA濃度的顯著