布拉氏酵母菌表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、布拉氏酵母菌是一種從印尼荔枝等水果中分離到的非致病性益生酵母菌，具有抗菌、抗毒、止瀉、維持宿主胃腸道微生態(tài)平衡、提高機體非特異性免疫力等益生性。目前，布拉氏酵母菌的研究主要集中在臨床應(yīng)用方面，而針對其作用機制，特別是在分子水平上的作用機制，以及遺傳改造等卻少有研究和報導(dǎo)。
　　自Smith提出表面展示技術(shù)以來，表面展示技術(shù)得到了快速發(fā)展。對于真核生物蛋白來說，酵母表面展示系統(tǒng)無疑是比較理想的表面展示系統(tǒng)。利用益生菌表面展示系統(tǒng)研究

2、活載體疫苗是醫(yī)學(xué)以及獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的應(yīng)用之一，人們已經(jīng)利用釀酒酵母和乳酸桿菌作為平臺研究活載體疫苗，而布拉氏酵母菌作為最有價值的益生菌之一，其表面展示系統(tǒng)在國內(nèi)外尚未有報導(dǎo)。
　　本研究利用a-凝集素成功地構(gòu)建了兩種布拉氏酵母菌表面展示系統(tǒng):瞬時表達表面展示系統(tǒng)和穩(wěn)定表達表面展示系統(tǒng)。這是第一次將表面展示技術(shù)用于布拉氏酵母菌中，拓寬了布拉氏酵母菌的應(yīng)用領(lǐng)域。
　　本研究主要做了以下三方面的工作:
　?。ㄒ唬┧矔r表達表

3、面展示系統(tǒng):
　　1.瞬時表達表面展示質(zhì)粒的構(gòu)建:將AGA1基因(SbAGA1)以及AGA2表達盒克隆到基礎(chǔ)質(zhì)粒pSP-G1上，使SbAGA1生持續(xù)表達啟動子pTEF1的控制之下，AGA2表達盒在持續(xù)表達啟動子pPGK1的控制之下，構(gòu)建了瞬時表達表面展示質(zhì)粒pSDSb;將SbAGA1基因和AGA2表達盒克隆到基礎(chǔ)質(zhì)粒pSP-G2上，使SbAGA1在持續(xù)表達啟動子pPGK1的控制之下，AGA2表達盒在持續(xù)表達啟動子pTEF1的控制之

4、下，構(gòu)建了瞬時表達表面展示質(zhì)粒pSDSb2。
　　2.利用EGFP蛋白作為報告蛋白，鑒定瞬時表達表面展示系統(tǒng)的可用性:將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因克隆到pSDSb、pSDSb2質(zhì)粒上的AGA2基因表達盒內(nèi)，構(gòu)建EGFP表面展示質(zhì)粒。熒光分析和Western blot結(jié)果表明，EGFP蛋白能夠展示在布拉氏酵母菌細胞表面。
　　3.不同來源的Aga1p對EGFP蛋白展示效率的比較:分析SbAGA1基因和ScAGA1基因的

5、同源性以及SbAGA2基因和ScAGA2的同源性，利用熒光分析和流式細胞術(shù)比較pSDSb和pSDSc兩種表面展示質(zhì)粒對外源蛋白的展示效率。熒光分析結(jié)果和流式結(jié)果表明，pSDSb和pSDSc兩種表面展示質(zhì)粒對外源蛋白的展示效率差異不顯著(P=0.974)。
　?。ǘ┓€(wěn)定表達表面展示系統(tǒng):
　　1.穩(wěn)定表達表面展示質(zhì)粒的構(gòu)建:破壞瞬時表達表面展示質(zhì)粒上的2-micron origin元件，構(gòu)建穩(wěn)定表達表面展示質(zhì)粒pLSDSb和

6、pLSDSb2。
　　2.利用EGFP蛋白作為報告蛋白，鑒定穩(wěn)定表達表面展示系統(tǒng)的可用性:將EGFP基因克隆到pLSDSb、pLSDSb2質(zhì)粒上的AGA2基因表達盒內(nèi)，構(gòu)建EGFP表面展示質(zhì)粒。熒光分析和Western blot結(jié)果表明，EGFP蛋白能夠展示在布拉氏酵母菌細胞表面。
　?。ㄈ┎祭辖湍妇砻嬲故鞠到y(tǒng)的應(yīng)用研究
　　1.瞬時表達與穩(wěn)定表達表面展示系統(tǒng)對EGFP蛋白展示效率的比較:利用熒光、流式分析比較兩

7、種表面展示系統(tǒng)對EGFP的展示效率，熒光結(jié)果表明:在培養(yǎng)24h時，瞬時表達表面展示系統(tǒng)可將EGFP展示在酵母細胞表面，培養(yǎng)120h后，熒光逐漸消失;與瞬時表達表面展示系統(tǒng)不同，在培養(yǎng)36h時，穩(wěn)定表達表面展示系統(tǒng)可將EGFP展示在酵母細胞表面，只要培養(yǎng)酵母細胞，外源蛋白可一直表達。流式結(jié)果表明:pSDSb-GFP的展示效率為87.89％，pLSDSb-GFP的展示效率為92.34％，pLSDSb2-GFP的展示效率為92.45％，說明穩(wěn)