依達(dá)拉奉對(duì)過氧化氫損傷的人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、背景和目的：
　　依達(dá)拉奉（EDAEdaravone）分子量小且脂溶性高，是一種效果較強(qiáng)的自由基清除劑，因此比較容易到達(dá)作用部位而發(fā)揮療效，臨床上主要用于腦缺血、腦梗死的治療。近年來，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及多組臨床觀察證實(shí)依達(dá)拉奉對(duì)心血管系統(tǒng)也有較好的保護(hù)作用，能改善多種心血管疾病的預(yù)后。干細(xì)胞是不斷更新且具有較強(qiáng)分化能力的細(xì)胞，可分成兩種：成體干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞。人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord-derive

2、d mesenchymal stem cells hUC-MSCs)，可分化為骨、脂肪、神經(jīng)等多種類型的細(xì)胞。并具有材料來源方便、無傷害，增殖迅速，低免疫原性的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)常被作為理想種子細(xì)胞用于治療心血管疾病，并取得良好效果。但由于炎細(xì)胞侵潤、缺血所導(dǎo)致的缺氧等因素的影響,在心肌損傷區(qū)會(huì)生成許多活性氧（reactive oxygen species ROS），引起氧化應(yīng)激狀態(tài)的發(fā)生，損害相應(yīng)細(xì)胞的活性，導(dǎo)致移植效果不佳。過氧化氫（hydr

3、ogen peroxide H2O2）是常見的活性氧，其在體內(nèi)可通過多種方式損害體內(nèi)的細(xì)胞。本研究即探討EDA對(duì)H2O2損傷的臍帶源干細(xì)胞的有效保護(hù)作用。
　　方法：
　　1、損傷hUC-MSCs合適的H2O2濃度及時(shí)間的確立分離所得相應(yīng)的hUC-MSCs后，在體外進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖、凍存、蘇醒以及鑒定并制作相應(yīng)的生長曲線；選取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用50、100、200、400、600、800、1000 mmo1/L H2O2處理1h、

4、4h、8h，確定實(shí)驗(yàn)室條件下?lián)p傷hUC-MSCs合適的H2O2濃度及損傷時(shí)間。
　　2、EDA對(duì)于H2O2損傷的臍帶源干細(xì)胞保護(hù)作用的研究應(yīng)用確定濃度的H2O2損傷hUC-MSCs確定相應(yīng)的時(shí)間，應(yīng)用10、40、80umol/L的EDA溶液培養(yǎng)經(jīng)H2O2損傷的hUC-MSCs1小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)，然后對(duì)培養(yǎng)所得的細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察，測定其相應(yīng)的代謝率，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)相應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果
　　1、損傷hU

5、C-MSCs合適的H2O2濃度及時(shí)間的確立從足月剖腹產(chǎn)健康胎兒臍帶中分離出hUC-MSCs后，經(jīng)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增純化、凍存復(fù)蘇，傳代所得的細(xì)胞表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣長梭形且形態(tài)較為單一，漩渦生長或平整排列生長，凍存再次蘇醒后細(xì)胞的活性基本無變化,使用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)的hUC-MSCs大量表達(dá)CD90、CD105，不表達(dá)CD34、CD45。生長曲線表明：hUC-MSCs在培養(yǎng)的3-6天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期；MTT法測定細(xì)胞的代謝率表明H2O2對(duì)hU

6、C-MSCs的損傷具有濃度與時(shí)間依賴性；MTT法測定相應(yīng)細(xì)胞的代謝率，使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞計(jì)數(shù)所得：均顯示600mmo1/L H2O2處理4h引起的hUC-MSCs的損傷處于適當(dāng)水平。損傷1小時(shí)時(shí)，每個(gè)H2O2濃度損傷組和正常的對(duì)照組相關(guān)細(xì)胞的MTT（OD）值差別均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞形態(tài)也無明顯變化；在H2O2處理4h時(shí)，50、100以及200mmol/L的H2O2損傷組和其對(duì)應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞的MTT（

7、OD）差別不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，400、600、800、1000mmol/LH2O2損傷組和其對(duì)應(yīng)的對(duì)照組之間均存在差別，并且隨著濃度的增大，MTT（OD）值呈逐漸下降趨勢；50、100、200以及400mmol/L的H2O2損傷組細(xì)胞形態(tài)與相關(guān)對(duì)照組不存在明顯的差別，600mmol/L的H2O2損傷組細(xì)胞與對(duì)照組相比發(fā)生變形，胞體變小，細(xì)胞間隙增寬，胞核模糊，但細(xì)胞邊界尚清楚， 細(xì)胞數(shù)量明顯減低；在800以及1000mmol/L

8、的H2O2損傷組相關(guān)細(xì)胞變形明顯，失去典型的長梭形，排列稀疏無法呈流水線生長，細(xì)胞邊界不清楚，有較多細(xì)胞脫落，細(xì)胞數(shù)量明顯減少；損傷8h時(shí)，每個(gè)濃度損傷組MTT（OD）值和對(duì)照組差別有意義，且隨濃度增大，MTT（OD）值呈逐漸下降趨勢；各濃度H2O2損傷組相關(guān)細(xì)胞變形明顯，失去典型的長梭形，排列稀疏無法呈流水線生長,細(xì)胞邊界不清楚，有較多細(xì)胞脫落，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　2、EDA對(duì)H2O2損傷的臍帶源干細(xì)胞保護(hù)作用的研究600m

9、mol/L的H2O2損傷hUC-MSCs4h后，應(yīng)用濃度不同的EDA溶液進(jìn)行培養(yǎng)1h、4h及8h，結(jié)果顯示：培養(yǎng)1h時(shí)，各EDA濃度組相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)、MTT值及數(shù)量與H2O2損傷組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；培養(yǎng)4h時(shí)，10、20umol/L的EDA組和H2O2損傷組細(xì)胞的MTT（OD）值、細(xì)胞數(shù)量的差別不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞形態(tài)無明顯區(qū)別；40、80umol/L的EDA培養(yǎng)組與H2O2損傷組相比MTT（OD）值、細(xì)胞數(shù)量均有明顯提升，且存在統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)意義；各濃度依達(dá)拉奉組之間MTT（OD）值、細(xì)胞數(shù)量隨依達(dá)拉奉濃度升高而升高，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨依達(dá)拉奉濃度升高，細(xì)胞形態(tài)較前正常，邊界清楚、平滑；培養(yǎng)8h時(shí)，10、20、40以及80umol/L的EDA培養(yǎng)組和H2O2損傷組比較MTT（OD）值、相關(guān)細(xì)胞數(shù)均有明顯提升，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各濃度依達(dá)拉奉組之間MTT（OD）值、細(xì)胞數(shù)量隨依達(dá)拉奉濃度升高而升高，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨依達(dá)拉奉濃度升高，細(xì)胞形態(tài)接近于正常，邊界清楚、平滑