YAP通過激活LRP1啟動子促進黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展.pdf

1、惡性黑色素瘤（黑色素瘤）是臨床上常見的皮膚黏膜和色素性惡性腫瘤，也是發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一。黑色素瘤系來源于能產生黑素細胞的惡性腫瘤，雖然可以發(fā)生于尿道、中樞神經系統(tǒng)和其他部位，但大部分皮損來源于皮膚。皮膚惡性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）是皮膚致死率最高的惡性腫瘤，具有易轉移、進展快、易耐藥、對放化療不敏感等特點。有數(shù)據統(tǒng)計顯示，近年來全球黑色素瘤新發(fā)病例以3％-7%速度增長1。20

2、14年數(shù)據顯示，在美國76100患者被診斷為黑色素瘤，其中9710患者死亡2,3。雖然黑色素瘤在歐美等白種人中具有較高的發(fā)病率，但近年來黑色素瘤在我國的發(fā)病率成倍增長，每年有新發(fā)病例約2萬例4。因此黑色素瘤已經成為危害我國人民健康的疾病之一。原發(fā)性惡性黑色素瘤在臨床上主要分為四型：肢端雀斑痣樣黑色素瘤、惡性雀斑痣樣黑色素瘤、結節(jié)性黑色素瘤和表淺擴散性黑素瘤。在亞洲人和有色人種中，原發(fā)于皮膚的惡性黑色素瘤約占50%-70%，最常見的原發(fā)部

3、位為肢端黑色素瘤，即足底、足趾、手指末端及甲下等部位，其次為粘膜黑色素瘤，如直腸、口與鼻咽等部位。
　　Hippo信號通路主要成分是核心激酶鏈，包括LATS1/2(large tumor suppressor1/2)、MST1/2(mammalian STE20-like protein kinase)、MOB(MOB kinase activator)和SAV1(human Salvador homology1),上述核心激酶能

4、夠調控器官的大小、維持細胞增殖和凋亡的平衡以及能夠調控細胞之間接觸性的連接作用。Hippo信號通路能夠維持表皮真皮交界處基底膜的黑素細胞密度。YAP（Yes-associated protein）是Hippo信號通路的轉錄激活因子。黑素細胞和大部分惡性黑色素瘤細胞系都表達 YAP蛋白。綜上所述，YAP蛋白在黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。
　　低密度脂蛋白受體相關蛋白-1（Low-density lipoprotein r

5、eceptor-related protein-1，LRP1）是一類具有清除細胞因子和信號傳導功能的細胞膜受體，可以介導多種細胞外基質中的分子內吞及代謝。LRP1在癌癥中發(fā)揮的作用是具有爭議性的，由于LRP1介導的內吞可以減少細胞外基質中蛋白酶的積累，有研究報道LRP1是抑制腫瘤細胞侵襲的一種關鍵受體分子。也有報道證明，LRP1可以促進腫瘤細胞的粘附，從而促進腫瘤細胞的侵襲。而LRP1在黑色素瘤發(fā)病中所起到的作用少有報道。
　　在

6、本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤 A375細胞中分別沉默/過表達 YAP基因和LRP1基因后，黑色素瘤A375細胞的增殖功能和轉移功能相對于正常表達YAP蛋白和LRP1蛋白的A375細胞有所減弱/增強，凋亡增強/減弱。我們進一步研究了YAP和LRP1蛋白之間的聯(lián)系以及LRP1蛋白作為黑色素瘤侵襲和轉移以及臨床診斷治療預后的指標的可能性。
　　目的：1.明確沉默/過表達YAP基因和LRP1基因后黑色素瘤A375細胞的功能實驗的一致性；2

7、.明確YAP蛋白和LRP1蛋白在惡性黑色素瘤皮膚組織芯片中和正常皮膚組織芯片中的表達情況；3.明確YAP蛋白和LRP1蛋白之間的關系，即YAP基因通過激活LRP1啟動子而促進LRP1蛋白表達；4.過表達LRP1蛋白可以逆轉沉默YAP基因后黑色素瘤細胞A375改變的增殖、凋亡和轉移能力。
　　方法：1.分別沉默/過表達黑色素瘤細胞A375的YAP基因和LRP1基因，測試MTT增殖實驗、Caspase3/7凋亡實驗、劃痕實驗和Tran

8、swell實驗；2.利用免疫組化實驗（IHC）測試組織芯片上正常皮膚組織和惡性黑色素瘤皮膚組織的 YAP蛋白和LRP1蛋白的表達情況；3.利用RT-PCR技術和Western-blot技術測定YAP基因沉默后黑色素瘤A375細胞YAP和LRP1的蛋白表達和mRNA和的情況；利用免疫熒光技術觀察YAP和LRP1蛋白是否有表達共定位；利用蛋白抑制劑CHX分別處理空白對照的黑色素瘤A375細胞和YAP基因過表達的黑色素瘤A375細胞，在0h、

9、1h、2h、4h、8h、24h利用Western-blot技術檢測YAP蛋白和LRP1蛋白的表達情況；利用雙熒光酶報告基因測試檢測LRP1啟動子（-2000bp to+150bp）在YAP基因敲除和過表達的黑色素瘤A375細胞中的激活情況；4.過表達LRP1基因能逆轉沉默YAP基因后削弱的致癌特性。
　　結論：YAP蛋白和LRP1蛋白均能促進黑色素瘤A375細胞的增殖和轉移，抑制凋亡；YAP基因通過激活LRP1的啟動子促進黑色素瘤