輻射誘發(fā)HL-7702細胞基因組不穩(wěn)定性研究.pdf

1、目的：在細胞、基因和蛋白水平上檢測60Co－γ射線誘發(fā)人肝細胞基因組的不穩(wěn)定性，并用基因芯片和雙向電泳-質譜技術探討其分子機制，篩選與輻射誘發(fā)基因組不穩(wěn)定性相關的基因和蛋白，為闡明輻射誘發(fā)基因組不穩(wěn)定性的分子機制提供基礎資料。
　　 方法：(1)采用60Co－γ射線照射人正常肝細胞7702(HL-7702)，照射劑量為OGy(對照組)、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy。檢測受照后7702細胞克隆存活率、微核形成率、單細胞

2、凝膠電泳(SCGE)、細胞凋亡率。(2)檢測各劑量點受照細胞子代的上述指標。(3)對各劑量受照細胞克隆子代同時給予2Gy的二次照射，然后檢測克隆存活率、微核形成率、單細胞凝膠電泳、細胞凋亡率。(4)分別提取經2、4、6Gyγ射線照射后子代細胞的總RNA，采用Illumina人全基因組基因芯片分析基因表達情況，并篩選出差異表達基因。(5)用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術驗證部分差異基因。(6)用GeneSpring GX10軟件對

3、差異表達基因進行生物信息學分析，并構建差異表達基因相互作用網絡。(7)提取受照射后子代細胞的總蛋白進行2-DE分離，考馬斯亮藍染色，差異表達點進行MALDI-TOF質譜分析，NCBInr數據庫搜索鑒定分析結果。(8)用Western blot方法驗證質譜鑒定出的差異表達蛋白熱休克蛋白60(HSP60)和珠蛋白轉錄因子1(GATA-1)在各劑量克隆子代中的表達。(9)用激光共聚焦顯微技術觀察差異表達蛋白HSP60、GATA-1和真核翻譯起

4、始因子5A(EIF5A)在各劑量克隆子代中的定位及表達。
　　 結果：(1)首次照射后，HL-7702細胞的克隆存活率、微核形成率、SCGE尾長、細胞凋亡率與照射劑量之間存在明顯的劑量效應關系。(2)首次照射后各劑量組存活的克隆子代細胞經傳代培養(yǎng)后，克隆存活率、微核形成率、SCGE尾長與對照組無顯著差異。(3)首次照射后各劑量組存活的克隆子代細胞經2Gy的二次照射后，上述檢測結果與首次照射劑量之間存在劑量效應關系。(4)基因芯片

5、測定2Gy照射后子代細胞差異表達顯著的基因有262個；4Gy照射組有2746個差異表達基因；6Gy照射組有3406個差異表達基因；三個劑量組的共同差異表達基因有71個，其中上調基因35個，下調基因36個。這些基因的功能涉及細胞周期、細胞骨架和運動、細胞凋亡、DNA結合、細胞信號轉導、代謝、DNA復制和修復等。利用生物信息學分析軟件構建了差異表達基因相互作用網絡圖并分析了RAN、CDT1、IER3、V-FOS等基因的生物學功能。(5)受照

6、射7702細胞克隆子代細胞雙向電泳圖譜與對照組相比，共發(fā)現差異蛋白點42個，其中10個上調蛋白，32個下調蛋白。經質譜分析，成功鑒定出17個差異表達蛋白，這些差異蛋白包括翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)、熱休克蛋白27(HSP27)、熱休克蛋白60(HSP60)、珠蛋白轉錄因子1(GATA-1)、巰基特異性抗氧化酶(TSA)、氯離子通道蛋白1(CLICI)、真核翻譯起始因子(EIFlA，EIF5A)、真核翻譯延長因子1(EEFlA)等。(6

7、)Western blot分析結果表明HSP60和GATA-1表達與受照劑量的關系與2-DE結果一致。(7)激光共聚焦結果顯示HSP60與EIF5A蛋白在細胞中表達豐富，主要分布于細胞質中細胞核的周圍。熒光定量分析結果與雙向電泳分析結果一致：
　　 結論：(1)電離輻射誘發(fā)的基因組不穩(wěn)定性可傳遞給受照細胞的后代，并在細胞復制多代后仍以潛在的方式存在于子代中，從而表現出滯后的遺傳學效應。基因組不穩(wěn)定性的發(fā)生與DNA的首次損傷事件之

8、間存在明顯的相關關系。(2)二次事件的放大作用在基因組不穩(wěn)定性的傳遞過程中起著重要的作用。二次損傷放大了處于不穩(wěn)定狀態(tài)的基因組損傷，使其更容易被檢測，因而可作為研究基因組不穩(wěn)定性的有效工具。(3)電離輻射可誘發(fā)HL-7702子代細胞中一系列基因與蛋白質表達的改變，提示基因組不穩(wěn)定性涉及復雜的調控機制。其中，RAN、CDT1、IER3、RAD51AP1、HAVCR2基因及HSP60、GATA-1蛋白在受照肝細胞子代中均顯示出特征性的差異表