NPM基因與輻射誘導的染色體不穩(wěn)定性.pdf

1、輻射誘導的基因組不穩(wěn)定性是多級致癌理論中一個關鍵的早期事件,在致癌過程中起著重要作用。染色體不穩(wěn)定性是基因組不穩(wěn)定性的表現形式之一,是多種惡性腫瘤的普遍特征。迄今為止,國內外對輻射誘導染色體不穩(wěn)定性的調控因子及調節(jié)機制尚不清楚。因此探尋其調控的關鍵基因及其作用機制,對于闡明輻射致癌的可能機制具有重要的理論價值,同時可能為腫瘤早期診斷和治療提供新的檢測手段和治療策略。
　　 核磷蛋白(Nucleophosrnin,NPM或B23)

2、是一種多功能的核仁磷酸化蛋白,參與核糖體的裝配運輸、DNA復制、中心體復制和有絲分裂等活動,其功能的發(fā)揮與p53狀態(tài)密切相關。它在增殖活躍的細胞如腫瘤細胞和干細胞中呈過度表達,被認為是細胞增殖、DNA損傷后細胞存活不可缺少的關鍵基因,尤其在啟動中心體復制、維持染色體穩(wěn)定性方面起著重要的作用。目前關于NPM在輻射誘導染色體不穩(wěn)定性中的作用尚不清楚,國內外均未見相關報道,NPM與p53的作用一直存在爭議。本研究采用不同p53狀態(tài)的人淋巴母細

3、胞系TK6(wtp53)和WTK1(mt-p53)細胞,觀察NPMmRNA和蛋白的差異表達與細胞增殖的關系,檢測NPM基因突變情況,以及在輻射誘導條件下NPM基因表達與細胞凋亡、染色體數目變化的關系,采用Olomoucine抑制NPM蛋白磷酸化,研究NPM基因與輻射誘導染色體不穩(wěn)定性及p53的關系,對NPM的作用機制作初步的探討。研究內容分為以下四個部分:
　　 第一部分:NPM基因在人淋巴細胞中的差異表達與細胞增殖
　　

4、 目的:研究不同p53狀態(tài)的淋巴母細胞株和人正常淋巴細胞永生化細胞系的增殖能力、染色體數量與NPM表達的關系。
　　 方法:在常規(guī)懸浮培養(yǎng)條件下,用軟瓊脂克隆形成法檢測人淋巴母細胞株TK6(wtp53)、WTK1(mtp53)和人正常淋巴細胞永生化細胞系的增殖能力,常規(guī)染色體分析技術檢測染色體數量的變化,同時采用RT-PCR、WestenBlot檢測NPMmRNA、總蛋白及磷酸化蛋白表達。
　　 結果:p53突變型WT

5、K1細胞的克隆形成能力約為p53野生型TK6細胞的2.75倍,兩者均顯著高于人正常淋巴細胞永生化細胞系的克隆形成能力約41倍和15倍。TK6和WTK1細胞的非整倍體率均約為54％,但TK(6細胞98％以上為整/近二倍體細胞,未發(fā)現有整/近四倍體及以上細胞,而WTK1細胞整/近二倍體細胞約占83％,整/近四倍體及以上細胞占11.4％。人正常淋巴細胞永生化細胞系(HNILL,)、TK6和WTK1細胞的NPMmRNA表達量為HNILL＜TK6

6、＜WTK1,但三者之間無顯著性差異:WTK1細胞NPM蛋白和磷酸化蛋白表達顯著高于TK6細胞,兩者均顯著高于人正常淋巴細胞永生化細胞。
　　 結論:p53突變型WTK1細胞與p53野生型TK6細胞、人正常淋巴細胞永生化細胞相比具有較強的細胞增殖能力且多倍體細胞所占比例高,三種細胞的增殖能力、染色體不穩(wěn)定性與NPMmRNA、蛋白和磷酸化蛋白表達呈正相關,而且與p53的狀態(tài)密切相關。
　　 第二部分:NPM基因在人淋巴細胞中

7、的突變分析
　　 目的:觀察TK6和WTK1細胞是否存在累及NPM基因的5號染色體易位或NPM第12外顯子的突變情況,探討細胞增殖能力變化是否與NPM基因突變有關。
　　 方法:采用染色體G顯帶分析法檢測TK6和WTK1細胞的染色體畸變,采用雙脫氧末端終止法(Sanger法)檢測NPM第12外顯子的突變情況,與人正常淋巴細胞永生化細胞系和2名健康人外周血淋巴細胞相比較。
　　 結果:TK6和WTK1細胞NPM第1

8、2外顯子非編碼區(qū)存在雜合T缺失,與1名健康青年人外周血淋巴細胞的測序結果完全相同;人正常淋巴細胞永生化細胞存在第12外顯子非編碼區(qū)純合T缺失,但TK6、WTK1細胞、人正常淋巴細胞永生化細胞和1名健康青年人外周血淋巴細胞的NPM基因第12外顯子的編碼區(qū)均未發(fā)生突變。另1名健康青年人外周血淋巴細胞的測序結果與GenBank數據庫序列完全一致。人正常淋巴細胞永生化細胞系、TK6、WTK1和1名健康青年人外周血淋巴細胞染色體G帶分析均未發(fā)現有

9、與5號染色體相關的易位。
　　 結論:在TK6和WTK1細胞中與NPM相關的功能只與NPM基因的表達有關。
　　 第三部分:γ射線照射對TK6和WTK1細胞NPM表達及染色體不穩(wěn)定性的影響
　　 目的:探討輻射誘導的凋亡、染色體不穩(wěn)定性與NPM表達、p53之間的關系。
　　 方法:用4Gy137Csγ放射源(劑量率為0.89Gy/min)照射TK6和WTK1細胞,采用流式細胞術檢測照射后24h的細胞凋亡率

10、;常規(guī)染色體分析技術檢測照射后Oh、6h、12h、24h、48h染色體數日變化;采用RT-PCR方法檢測Oh、1h、3h、6h、12h、24hNPMmRNA表達的變化;采用WesternBlot檢測照射后Oh、3h、6h、12h、24h、36h、48h的NPM總蛋白及磷酸化蛋白的變化。
　　 結果:4Gyγ射線照射后24h,TK6和WTK1細胞的凋亡率均顯著高于未照射對照組,且TK6細胞的凋亡率顯著高于WTK1細胞。4Gy照射后

11、從6h開始至48h,TK6與WTK1細胞非整倍體率均明顯高于未照射對照組,從未照射時的54.3％增加至79～85％:照射后48hTK6與WTK1細胞的多倍體率明顯增加,TK6細胞由未照射時的1.4％升高到13.5％,主要為整/近三倍體從1.4％增加全10.8％,整/近四倍體從0％增加至2.7％;而WTK1細胞的多倍體率則由未照射時的17.1％升高到67％,主要表現為整/近四倍體從11.4％增加至48％,整/近三倍體從4.3％增加至12％

12、。TK6細胞在4Gy照射后0-24hNPMmRNA表達無明顯變化,照射后0-48hNPM蛋白及磷酸化蛋白水平亦無明顯變化,而WTK1細胞于照射后12-24hNPMmRNA表達較未照射時降低,NPM蛋白水平于照射后12-48h顯著低于未照射對照組,但磷酸化NPM蛋白于照射后12h-24h呈現短暫的升高后降至未照射組的水平。
　　 結論:輻射誘導p53突變型WTK1細胞的染色體不穩(wěn)定性顯著高于p53野生型的TK6細胞,而TK6細胞的

13、凋亡率明顯高于WTK1細胞,可能與γ射線誘導NPMmRNA、蛋白及磷酸化蛋白表達及p53狀態(tài)有關。
　　 第四部分:Olomoucine對輻射誘導細胞凋亡與染色體不穩(wěn)定性的影響
　　 目的:觀察Olomoucine抑制CDK2/cyciinE激酶活性后,對輻射誘導細胞凋亡和染色體不穩(wěn)定的影響。
　　 方法:TK6和WTK1細胞用10μmol幾的Olomoucine處理6h后接受4Gyγ射線照射,分別于照后24h與

14、48h檢測細胞凋亡和染色體數目的變化。
　　 結果:Olomoucine使4Gy照射誘導的TK6和WTK1細胞的凋亡率比單純照射組顯著增加,TK6細胞由33.5％上升到43.9％,而WTK1細胞由16.8％升高到25.1％,且TK6細胞的凋亡率明顯高于WTK1細胞。照后48hOlomoucine使TK6細胞的多倍體率由單純照射的13.5％降至為0,WTK1的多倍體細胞所占比例由單純照射組的67％降至18％,恢復至未照射對照組水平