STAT3及其相關競爭性內源RNA在肝內膽管癌中的表達與調控機制的初步研究.pdf

1、本文從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 STAT3及其相關競爭性內源RNA在肝內膽管癌中的表達與調控機制的初步研究
　　目的:
　　本實驗的目的在于通過研究轉錄信號傳導因子及激活子3(Signal Transducer and Activator of Transcription3，STAT3)在肝內膽管癌中的表達情況，明確腫瘤原發(fā)灶、近腫瘤肝組織以及淋巴結中STAT3表達及其差異，并從數據庫中篩選STAT3相關的競

2、爭性內源RNA(Competing endogenous RNAs，ceRNA)，明確ceRNA與STAT3的表達相關性，并進一步驗證候選ceRNA在STAT3調控肝內膽管癌過程中的作用。
　　肝內膽管細胞癌(ICC)的發(fā)病率約占肝臟原發(fā)性腫瘤的10％至15％，是發(fā)病率僅次于肝細胞癌的肝臟原發(fā)惡性腫瘤。肝內膽管細胞癌起源于肝臟的二級膽管及其分支上皮，其病理學種類多數為不同分化程度的腺癌，癌細胞浸潤性侵襲匯管區(qū)血管或神經。因其浸潤性

3、生長的特點，ICC形成肝內轉移或侵襲肝外淋巴結甚至臨近器官的幾率大于其他肝臟原發(fā)的惡性腫瘤。在實際的臨床診療過程中，ICC與其他的肝臟原發(fā)的惡性腫瘤相比切除率、治愈率更低，并且缺乏有效的輔助治療方法。截止到目前為止手術切除仍是治愈肝內膽管癌唯一有效的途徑，但因肝內膽管癌初期癥狀不明顯且病程發(fā)展較快，確診時有機會接受根治性手術治療的患者并不占多數。
　　STAT3是一類在各種組織與細胞中廣泛表達的癌基因，STAT3通過磷酸化的方式被

4、激酶活化，經過活化后STAT3通過細胞因子以及生長因子將其信號向細胞核內傳遞，從而達到影響靶基因轉錄的效果。如促進細胞增殖、細胞生成、促進或抑制微血管生成、細胞粘附等， STAT3是JAK-STAT信號轉導通路的組成部分。
　　競爭性內源RNA(ceRNAs)假說:不同種類的RNA之間可以通過位于RNA上的microRNA的結合位點(MREs)競爭性的結合，這種彼此之間的競爭性的結合實現了ceRNAs之間調控表達的互相影響，因而形

5、成了一種龐大的競爭性內源RNA調控網絡。
　　STAT3的表達在近期的多項研究中被證實密切影響著腫瘤的預后，急性髓細胞性白血病、皮膚癌、非小細胞型肺癌等腫瘤的無瘤生存期、5年生存率以及中位生存時間被證實與STAT3的表達相關。而針對上述腫瘤發(fā)病機制的研究表明，microRNA可直接或間接的參與STAT3在腫瘤中的活化調控。根據競爭性內源RNA假說，ceRNA可通過共同的microRNA結合位點對其競爭性的結合，這就提示我們micr

6、oRNA可作為中介將ceRNA與STAT3聯(lián)系在一起。查閱文獻后，我們發(fā)現尚未有研究明確ceRNA在肝內膽管癌中調控STAT3的表達，這為我們的研究奠定了理論基礎。
　　方法:
　　病理評分區(qū)分表達情況:
　　對納入本實驗的組織標本（腫瘤組織、近腫瘤肝組織、淋巴結組織）進行免疫組化染色，并根據免疫組化顯色的結果進行評分（陽性細胞著色程度，陽性細胞占所觀察同類細胞數的百分比），區(qū)分STAT3在腫瘤組織中的高表達與低表達。

7、
　　功能學實驗:
　　本研究構建了以pcDNA3.1(-)為載體的STAT3過表達質粒，并將pcDNA3.1-STAT3以及pcDNA3.1空載體導入膽管癌9810細胞系中。通過劃痕實驗和transwell實驗，探究STAT3過表達對9810細胞遷移能力的影響。
　　機制實驗:
　　查詢ceRNA數據庫中篩選STAT3可能的候選ceRNAs(ACSL4、IFNAR2、MAP3K5、MAP3K9、SOD2、TNF

8、RSF10B、XIAP、LncRNA-NEAT1)，RT-PCR檢測8種候選ceRNAs與STAT3表達之間的關系。應用小分子siRNA干擾候選ceRNA，Real-Time PCR和Western-blot檢測STAT3的表達情況，初步明確ceRNA對STAT3表達調控作用。
　　結果:
　　免疫組化結果顯示，在48例肝內膽管癌患者腫瘤組織內STAT3陽性表達率為85.4％(48例標本中有41例呈陽性表達);而48例近腫瘤

9、肝組織標本中STAT3的陽性表達率為12.5％。納入本實驗的病例中有16例患者發(fā)生了淋巴結轉移，我們檢測轉移淋巴結與原發(fā)腫瘤灶中STAT3的表達情況，發(fā)現其中13例淋巴結STAT3表達水平比原發(fā)腫瘤中高，占淋巴轉移患者總體的81.5％。膽管癌細胞系中導入STAT3過表達質粒pcDNA-STAT3，劃痕實驗以及transwell實驗表明導入STAT3過表達的9810細胞遷移能力高于導入空載體的9810細胞。PCR結果提示我們:8種候選ce

10、RNA表達水平與STAT3表達水平呈正相關，其中LncRNA-NEAT1的表達與STAT3呈顯著相關(P＜0.001)。根據以上數據提示并經文獻查閱后我們以LncRNA-NEAT1作為主要研究對象，分別采用干擾LncRNA-NEAT1的siNEAT1以及對照siRNA轉染RBE細胞，發(fā)現實驗組相較于對照組LncRNA-NEAT1以及STAT3的RNA表達水平均下調。Western-blot結果提示實驗組相較于對照組STAT3表達降低。<

11、br>　　結論:
　　STAT3在肝內膽管癌腫瘤組織中表達高于近腫瘤肝組織;STAT3能夠促進肝內膽管癌細胞的轉移侵襲能力;候選ceRNAs（LncRNA-NEAT1）與腫瘤組織中STAT3的表達水平呈顯著正相關(P＜0.001);LncRNA-NEAT1作為競爭性內源RNA可以調節(jié)STAT3的表達。
　　第二部分 循環(huán)腫瘤細胞在原發(fā)性肝細胞癌患者外周血中分離捕獲技術及其應用
　　目的:
　　本研究利用循環(huán)腫瘤細

12、胞直徑大于正常細胞的特征，采用特定孔徑薄膜濾過富集的方法分離肝細胞癌患者外周血中的循環(huán)腫瘤細胞。排除正常細胞干擾后對循環(huán)腫瘤細胞進行計數，結合實驗室檢查數據、臨床資料、病理結果等分析循環(huán)腫瘤細胞計數與肝細胞癌腫瘤形成之間的關系。應用顯微切割分離已捕獲的單個循環(huán)腫瘤細胞，并通過單細胞基因組擴增技術擴增循環(huán)腫瘤細胞基因組，為肝細胞癌患者循環(huán)腫瘤細胞高通量測序做前期的準備工作。
　　循環(huán)腫瘤細胞（CircuLating tumor ce

13、ll，CTC）概念的首次提出距今已有一百四十余年的歷史，CTC是指進入外周血中的惡性腫瘤細胞。最近十年來因為富集、分離、鑒別手段的豐富，CTC才得到較為系統(tǒng)的研究。文獻報道證實， CTC在腫瘤的轉移及復發(fā)中扮演著重要的角色。應用CTC作為標志物檢測早期患者以及監(jiān)測化療藥物的耐藥性已經在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結腸癌的臨床診療中得到部分應用。循環(huán)腫瘤細胞微栓子（Circulating tumor microemboli，CTM）是由三個或

14、三個以上CTC聚集而成的癌細胞栓子，CTM的出現已被近期研究證實與胰腺癌、前列腺癌等腫瘤晚期遠處轉移密切相關。
　　原發(fā)性肝細胞癌(HCC)的發(fā)病人群常見于HBV感染史、飲酒史的中年男性或絕經期后女性，因其生長速度快、早期無明顯癥狀導致手術根治性切除率低預后差。據統(tǒng)計2012年我國原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)病率占全球發(fā)病率的52.7％為世界第一，我國東部沿海地區(qū)HCC發(fā)病率高于西部內陸省份，男性發(fā)病率顯著高于女性（平均4.15∶1）。在全

15、球范圍內雖然通過推廣新生兒乙肝疫苗的注射以及針對乙肝病毒攜帶者腹部超聲檢查降低了HCC的發(fā)生率并且提高了腫瘤的早期檢出率，但因各種客觀條件制約以及HCC本身的生物學特性導致其病死率依然居高不下。
　　CTC因其本身在腫瘤轉移和復發(fā)中扮演的重要角色，被應用在監(jiān)測HCC轉移及復發(fā)的機制研究上。而CTC所攜帶的基因組與腫瘤組織基因組的同源性，可被應用于化療藥物耐藥性的監(jiān)測。我們的研究嘗試從肝癌患者外周血中分離捕獲CTC并擴增其攜帶的基因

16、組，從而達到體液活檢的目的。
　　方法:
　　實驗對象為經東方肝膽外科醫(yī)院確診的原發(fā)性肝細胞癌患者，在取得知情同意后，取患者外周血6ml。應用友芝友公司生產YZY-CTC-BIOPSY異常細胞分離染色儀截留細胞，通過腫瘤細胞形態(tài)學與正常細胞的區(qū)別鑒別CTC，并應用免疫熒光染色的方法對CTC進一步確認（有效排除正常細胞干擾）。對確認后的CTC進行計數，統(tǒng)計患者術后病理學資料、實驗室檢查結果、臨床檢測指標，分析計數與疾病及其病理

17、數據之間的關系。顯微激光切割的方法將CTC分離，利用單細胞基因組擴增技術擴增CTC基因組，用于高通量測序或腫瘤病人耐藥性檢測等個體化精準醫(yī)療的開展。
　　結果與結論:
　　本研究應用CTC-BIOPSY異常細胞分離染色儀可以有效的將循環(huán)腫瘤細胞(CTC)以及循環(huán)腫瘤細胞微栓子(CTM)截留在篩孔濾膜上;免疫熒光染色鑒別可以有效的排除WBC對CTC計數的影響:顯微激光切割平臺可以捕獲薄膜截留的CTC細胞，并在收集時將CTC與正