重組CD13單鏈抗體-蝎毒素AGAP融合蛋白的原核表達及其對NB4細胞的作用.pdf

1、目的： 本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)方法，構(gòu)建CD13單鏈抗體/蝎毒素AGAP融合基因的原核表達載體pRSETA/AGAP/CD13scFv，在原核表達系統(tǒng)內(nèi)表達并純化重組目的蛋白，并通過體外實驗觀察該重組蛋白對CD13陽性腫瘤細胞株NB4的作用。 方法： 1.構(gòu)建pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/cD13scFv重組表達載體：利用RT-PCR法從東亞鉗蝎尾腺中獲得AGAP目的基因，用TA克

2、隆法將目的基因連接至克隆載體PCR-TOPO，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定克隆載體PCR-TOPO/AGAP及測序進一步鑒定AGAP序列正確性；再經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后克隆至表達載體pRSETA，PCR初步鑒定重組表達載體pRSETA/AGAP，EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定pRSETA/AGAP，最后測序進一步鑒定pRSETA/AGAP序列的正確性；以質(zhì)粒pSecTag2HygroC為模板，PCR反應(yīng)擴增目的片段CD

3、13scFv，將PCR產(chǎn)物膠回收純化后進行測序鑒定CD13scFv序列的正確性，再經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后克隆至重組表達載體pRSETA/AGAP，PCR初步鑒定重組表達載體pRSETA/AGAP/CD13scFv，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定pRSETA/AGAP/CD13scFv，最后測序進一步鑒定pRSETA/AGAP/CD13scFv序列的正確性。再用與pRSETA/AGAP同樣的方法構(gòu)建pRSETA/CD13scFv重

4、組表達載體。 2.pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/CD13scFv重組表達載體在原核細胞內(nèi)的表達、鑒定及純化：將pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/CD13scFv重組表達載體轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，加用IPTG誘導(dǎo)表達，在大腸桿菌內(nèi)表達CD13scFv/AGAP融合蛋白及CD13單鏈抗體蛋白，超聲裂解細菌提取蛋白質(zhì)，并進一步用ProBondTMNickel-Chelating Re

5、sin純化柱結(jié)合并純化融合蛋白CD13scFv/AGAP及CD13單鏈抗體蛋白，通過SDS-PAGE、Western Blot分析制備目的蛋白。 3.融合蛋白CD13scFv/AGAP在體外對CD13陽性腫瘤細胞株NB4的作用：將融合蛋白CD13scFv/AGAP與CD13陽性白血病細胞株NB4細胞共同培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察NB4細胞株生長狀態(tài)；CCK-8檢測融合蛋白對腫瘤細胞NB4的生長抑制率，并與對照組比較(Raji細胞組、

6、CD13單鏈抗體蛋白組)抑制率；AnexinV法經(jīng)流式細胞儀檢測腫瘤細胞NB4的凋亡情況；PI染色法經(jīng)流式細胞儀檢測融合蛋白CD13scFv/AGAP對NB4白血病細胞株細胞周期的影響。 結(jié)果： 1、重組原核表達載體pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/CD13scFv經(jīng)測序其目的片段分別與理論預(yù)計一致。 2、重組原核表達載體轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌后，加入0.5mM IPTG37℃誘導(dǎo)4小

7、時后，通過SDS-PAGE電泳、Werstern Blot分析外源蛋白的表達，表達產(chǎn)物即CD13scFv/AGAP融合蛋白、CD13單鏈抗體蛋白均主要以不溶性的包涵體形式存在。 3、融合蛋白CD13scFv/AGAP在體外與CD13陽性的白血病細胞株NB4共同培養(yǎng)后，在顯微鏡下觀察NB4細胞株碎片增加，數(shù)量明顯減少；CCK-8顯示不同濃度的融合蛋白CD13scFv/AGAP作用于NB4細胞后，能夠明顯抑制NB4細胞的生長，且其

8、作用在一定范圍內(nèi)呈對濃度和時間的依賴性，其抑制率與對照組(Raji細胞組、CD13單鏈抗體蛋白組)相比明顯提高(P<0.01)；流式細胞術(shù)分析顯示融合蛋白CD13scFv/AGAP作用于NIM細胞后，凋亡率與對照組相比明顯升高(P<0.01)；流式細胞術(shù)分析還顯示融合蛋白CD13scFv/AGAP作用于NB4細胞后，細胞周期阻滯于G0/G1期(P<0.01)，阻止其進入S期及G2/M期。 結(jié)論： 1、通過分子克隆等技