蜂毒素-SP94融合蛋白原核表達載體的構(gòu)建、表達及其純化.pdf

1、河南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文蜂毒素-SP94融合蛋白原核表達載體的構(gòu)建、表達及其純化姓名：曹靜申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生理學(xué)指導(dǎo)教師：張紅緒20100401A B S T R A C TL i v e r c a n c e r i so n e o f t h e m o s tc o m m o n m a l i g n a n t t u m o r si nC h i n a ．T h e c u r r e n tt r e a

2、 t m e n t s a r em a i n l yr a d i o t h e r a p y , c h e m o t h e r a p y a n ds u r g e r y , b u t r a d i o t h e r a p ya n dc h e m o t h e r a p yc a nd a m a g et h es u r r o u n d i n gn o n c a n c e r o u

3、 sc e l l ss e r i o u s l y ．T a r g e t i n gt h e r a p ym a k e sd r u gm o l e c u l e ss p e c i f i c a l l yb i n d i n gt o t u m o rc e l l sw h i c h j u s t d a m a g e sl i t t l e n o r m a lc e l l s ．I th

4、 a so v e r c a m et h ed r a w b a c k so fc o n v e n t i o n a lt r e a t m e n t ，S Ot h et a r g e t i n g t h e r a p y o f l i v e rc a n c e r h a s b e c a m e ah o t s p o t i nr e c e n t r e s e a r c h ．M e

5、l i t t i n i S a c l a s so fa n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s i n h o n e y b e ev e n o ma n dc o n s i s t s o f2 6a m i n oa c i d s ．M e l i t t i np l a y sa p a r t i na n t i - i n f l a m m a t o r y t

6、h e r a p y , a c e s o d y n e ，i n h i b i ta r t h r i t i s ，a n t i v i r u s ，a n t i - t u m o ra n do t h e r s ，b u tm o r e p r o n o u n c e dt o x i c i t y w h e ni t i su s e da l o n e ．T oi m p r o v e e

7、f f e c ta n d d e c r e a s et o x i c i t y , f u s i o np r o t e i n W a s f o r m e d b y c o n n e c t i n gM e l i t t i na n dS P 9 4 w h i c h c o u l d s p e c i f i c a l l yb i n d t ot h e s u r f a c eo f t

8、 u m o rc e l l s ．A c c o r d i n g t o E ．c o l i c o d o nb i a s ，t h es e q u e n c eo ff u s i o n p r o t e i n W a s c h a n g e da n dt h er e s t r i c t i o ne r l z y m e s i t e s o fK p n I a n d X h 0 1 w

9、e r e a d d e di n i t t o c o n s t r u c t t h e r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o n v e c t o rp E T 3 2 a - M e l i t t i n —S P 9 4 ．T h e f u s i o ng e n e W a s e x p r e s s e da n dt h ep u r i f i e df u

10、 s i o np r o t e i nw a s p r e p a r e d ．T h es t u d y p r o v i d e dn e w i d e a s f o rt a r g e t e dt h e r a p y i n l i v e rc a n c e r r e s e a r c ha n dc l i n i c a la p p l i c a t i o n s ．I nt h e e

11、x p e r i m e n t ，M e l i t t i n —S P 9 4 f u s i o ng e n e w a s o b t a i n e db yP C R a n di n s e r t e di n t op E T 3 2 a v e c t o r s ．T h er e c o m b i n a n tv e c t o r sw e r et r a n s f o r m e di n t

12、oE c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) a n d e x p r e s s i o no ft h er e c o m b i n a n tp r o t e i nW a si n d u c e d b yI P T Gi n d u c t i o n ．T h ei n d u c e dm a t u r er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a s p u r i

13、 f i e db yN i 2 +a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y , d i a l y s i s ，d e s a l t i n g ，c l e a v i n gb y e n t e r o k i n a s ea n d f r e e z e - d r y i n g ．I nc o n c l u s i o n ，t h er e c o m b i n

14、a n tv e c t o rp E T 3 2 a ·M e l i n i n - S P 9 4h a d b e e nc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l ya n du s e di np r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ．p E T 3 2 a - M e l i t t i n - S P 9 4h i g h l

15、ye x p r e s s e di nE ．c o l i ，a n d s o l u b l ef u s i o np r o t e i nc o u l d b ea c c u m u l a t e dt o ah i g hp e r c e n t ．T h er e c o m b i n a n t p r o t e i nW a sa b o u t3 0 ％o f t o t a lc e l l u l

16、 a rp r o t e i n ．5 0 ％o ft a r g e t p r o t e i n W a ss o l u b l e a f t e r u l t r a s o n i c a t i o n ．S D S ·P A G E d e m o n s t r a t e d t h a t t h em o l e c u l a r w e i g h t o ft h e f u s i o n

17、p r o t e i nw a sc o n c o r d a n t 、衍m t h et h e o r e t i c a lv a l u e ．H i g hp u r i t yp r o t e i n W a so b t a i n e da f t e r p u r i f i c a t i o n ．T h e r e f o r e ，t h ep E T 3 2 a —M e l i t t i n -

18、 S P 9 4W a s s u i t a b l ef o r p r o d u c i n gf u s i o np r o t e i nM e l i t t i n - S P 9 4 i nl a r g e - s c a l e ，w h i c hc o u l d b eu s e da sn e w c a n d i d a t em e d i c i n e p r o t e i n i nt a