抗NI-35重組單鏈抗體表達載體的構(gòu)建與融合表達.pdf

1、目的:該文并人工合成抗NI-35重組單鏈抗體(anti-NI-35-scfv)的cDNA克隆,構(gòu)建其表達載體,在原核系統(tǒng)中實現(xiàn)初步表達.它由抗體分子中構(gòu)成抗原結(jié)合部位的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)借助一連接短肽連接而成,由于只保留了V區(qū),免疫源性大大降低,同時由于沒有Fc段,不能與非靶細胞的Fc受體結(jié)合,更利于集中到到損傷部位.此外,分子小是單鏈抗體的一大優(yōu)勢,目前認為,scFv是能夠保持與抗原有效結(jié)合的最小單位.完整抗體在構(gòu)建為單鏈抗體以后

2、,其分子量通常只為原有分子的1/5或1/6,較小的分子量使其在體內(nèi)的分布指數(shù)較完整抗體有明顯升高,更有利于臨床應(yīng)用.結(jié)論:我們成功合成了anti-NI-35抗體的輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)cDNA序列,并通過中間接頭(Gly4Ser)3將二者連接起來,重新構(gòu)建了anti-NI-35的重組單鏈抗體cDNA全基因,并克隆至載體pUC18中,測序正確.采用含有6xHis-tag的融合蛋白表達系統(tǒng).將構(gòu)建好的scFv基因經(jīng)常規(guī)轉(zhuǎn)化和篩選克隆至PET

3、-28a(+)表達載體,并由IPTG誘導(dǎo)在E.coli BL21中表達anti-NI-35-scFv蛋白.表達產(chǎn)物長278個氨基酸,分子量約為31.0kD,以包涵體形式存在,同時該實驗利用鎳-次氨基三乙酸(Ni-NTA resin)金屬親和層析基質(zhì)對6xhis-tag的特異親和性完成對scFv的純化,獲得了純度為86％的高純度表達蛋白.蛋白濃度達到1.2mg/ml.抗NI-35重組單鏈抗體(anti-NI-35-scFv)基因表達載體的