百草枯對人肝HepG2細胞的毒理學研究.pdf

1、百草枯(PQ)是一種水溶型除草劑，因其易于被土壤吸附、在環(huán)境中殘留量相對較低和具有良好的除草效果，PQ先后在全球120多個國家被廣泛使用。但自1962年注冊生產(chǎn)以來，PQ已經(jīng)引起了嚴重的公共健康問題，由 PQ導致的自殺、謀殺、誤服以及生產(chǎn)和使用接觸的中毒死亡事件時有報道，而PQ的毒性機制至今仍不清楚，目前針對PQ中毒也沒有的良好治療策略和高效解毒劑。
　　通過對PQ中毒病人、死者和動物進行研究，人們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)蓄積的PQ主要存在于肺，

2、而腎作為水溶物質(zhì)的排泄器官，其在PQ中毒之后發(fā)生的變化也被大量調(diào)查。此外，近年來的慢性毒性實驗發(fā)現(xiàn)，PQ引起的部分病理特征與一些早老疾病癥狀相似，隨之PQ的神經(jīng)毒性也引起了人們的廣泛關(guān)注。但PQ中毒對人肝的影響一直未被深入探討。
　　眾所周知，肝是機體最重要的解毒器官，在外源毒物的降解過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，因此解明肝在PQ處理后發(fā)生的變化對全面理解PQ的毒性效應及機制具有重要意義，也有利于尋找新的方法提高肝對PQ的抵抗力、增

3、強肝對PQ中毒的消解作用。人肝癌細胞 HepG2具有肝細胞的多種代謝和轉(zhuǎn)化酶系，是良好的肝細胞研究模型，故本文以 HepG2細胞作為實驗材料，運用一系列細胞和分子生物學新技術(shù)開展研究，探討PQ對HepG2細胞的毒性效應及可能機制。
　　首先，本研究從細胞水平上，采用6種方法，選擇存活力、生長狀況、周期、凋亡和突變5個指標評估了PQ處理24 h對HepG2細胞的毒性效應。其中，MTT實驗結(jié)果顯示PQ對HepG2細胞存活力的24 h-

4、IC50為51.17 mg/L，顯微觀察發(fā)現(xiàn)7.21 mg/L的PQ即可導致細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變、貼壁能力下降、生長受到抑制，BrdU和PI雙色流式實驗檢測到23.36 mg/L的PQ即可導致細胞周期停滯(S期細胞減少、G1和G2期細胞增多)，annexin V和PI雙色流式實驗檢測到7.21 mg/L的PQ即可誘導細胞凋亡，微核(MN)和姊妹染色單體交換(SCE)實驗結(jié)果表明7.21 mg/L的PQ可導致HepG2細胞的突變率

5、大大提高，HepG2細胞發(fā)生的這些毒性效應的程度均與PQ處理濃度呈正相關(guān)。此外，本研究在MN實驗操作之前對HepG2細胞進行了低滲處理，結(jié)果提高了MN圖像的分辨力，這對于增加同類細胞MN實驗的準確率和效率均具有重要意義。
　　隨后，本研究從分子水平上，調(diào)查了PQ處理24 h對HepG2細胞基因組DNA穩(wěn)定性的影響，以分析PQ對HepG2細胞毒性效應的可能機制。單細胞凝膠電泳、隨機擴增多態(tài)性和高效液相色譜(HPLC)實驗結(jié)果顯示，P

6、Q可導致HepG2細胞發(fā)生明顯的基因組DNA斷裂損傷、多態(tài)性下降和甲基化升高，且基因組的這些變化與PQ處理濃度呈正相關(guān)。定量PCR和免疫印跡實驗的結(jié)果表明，HepG2細胞內(nèi)抑制斷裂雙鏈DNA(dsDNA)進行同源重組(HR)修復的細胞因子BLM和DNA ligase I的表達量隨PQ處理濃度增大而減少，即PQ處理后HR修復增強，這表明HepG2細胞對PQ導致的基因組不穩(wěn)定有明顯的應激反應，該反應也合理地解釋了PQ導致的SCE頻率增高；而

7、HepG2細胞內(nèi)促進斷裂dsDNA進行非同源末端連接(NHEJ)修復的細胞因子Ku70的表達量隨PQ處理濃度增大呈先增多后減少變化，NHEJ修復的先增強顯然也是HepG2細胞對PQ導致基因組不穩(wěn)定性產(chǎn)生的應激反應，但后減弱則意味著NHEJ修復最終走向崩潰，難以挽救PQ導致的基因組不穩(wěn)定。
　　進一步，采用流式細胞術(shù)、HPLC和 ELISA等方法系統(tǒng)評價了 PQ處理后 HepG2細胞發(fā)生的氧化應激反應和氧化損傷。結(jié)果顯示，低濃度PQ

8、處理組HepG2細胞超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力有所提高，所有PQ處理組HepG2細胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽含量均增多，表明 HepG2細胞對 PQ導致的氧化損傷產(chǎn)生了應激反應；但同時發(fā)現(xiàn)所有PQ處理組HepG2細胞內(nèi)活性氧和丙二醛含量均較多，表明氧化應激反應不足以平衡氧化損傷；因此同時檢測到PQ處理組DNA氧化產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的含量明顯多于正常組。DNA發(fā)生氧化損傷可能正是PQ導致HepG2細胞基因組不穩(wěn)定的直接原因。
　　最后

9、，采用火焰原子吸收法檢測到PQ處理導致HepG2細胞內(nèi)Ca、Mg和Zn含量失衡。其中，Ca的含量增加可能是Ca活化途徑介導細胞凋亡的體現(xiàn)，不利于細胞存活；Mg含量的減少則會阻滯細胞生長和分裂，同時不利于基因組的穩(wěn)定；而Zn含量的減少不僅會促進細胞凋亡，而且不利于基因組穩(wěn)定性的維持和DNA氧化損傷的防止。
　　綜上所述，PQ處理可能首先導致HepG2細胞發(fā)生了嚴重的DNA氧化損傷和Ca、Mg及Zn含量的失衡，進而引起基因組穩(wěn)定性下降